免疫熒光實驗方法2

（二）固定和通透
 
除研究細胞表面抗原或不穩定抗原可不固定外，一般均應固定。固定的目的有三：
 
①防止細胞從玻片上脫落；
 
②除去防礙抗原-抗體結合的類脂；
 
③使標本易于保存。
 
標本的固定原則是：
 
①不能損傷細胞內的抗原；
 
②不能凝集蛋白質；
 
③應保持細胞和亞細胞結構；
 
④固定后應保持通透性，以保證抗體自由進入所有細胞與亞細胞組分與抗原結合。
 
常用的固定劑有多種，應根據所研究抗原的性質和所使用的抗體特性選擇適當的固定劑。通常固定方法可以分為兩類：有機溶劑和交聯劑。有機溶劑如甲醇和丙酮等可去除類脂并使細胞脫水，同時將細胞結構蛋白沉淀。交聯劑如多聚甲醛通常通過自由氨基酸基團形成分子間橋連，從而產生一種抗原相互連接的網絡結構。交聯劑比有機溶劑更易于保持細胞的結構，但因為交聯阻礙抗體結合，可能會降低一些細胞組分的抗原性，因此需要增加一個通透步驟以使抗體能夠進入標本。兩種固定方法都可能使蛋白抗原變性，因此使用變性蛋白作為抗原生產的抗體在免疫熒光中可能更為有效。
 
最常用的固定劑有多聚甲醛和甲醇，少數情況也使用乙醇，丙酮及戊二醛等進行固定。通常，細胞結構抗原、病毒及一些酶類抗原使用丙酮、乙醇及高濃度的甲醛固定可獲得較好的結果，而細胞膜相關組分抗原一般以多聚甲醛固定。細胞器和細胞顆粒內的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要進行通透以使抗體能達到抗原表位。

通透步驟只在檢測細胞內抗原表位的時候才需要，因為抗體需要進入細胞內部去檢測蛋白。但是，如果待檢測的是跨膜蛋白，且其抗原表位處于胞質內區域，則同樣需要對細胞進行通透。相反，如果所檢測的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，則不需要進行通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作為固定劑時是不需要通透的。甲醇同樣具有通透作用，但有些場合并不適合用甲醇，因為一些表位對甲醇非常敏感。常用的通透劑是去垢劑，如Triton ,NP-40,以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40屬于烈性去垢劑，可部分溶解細胞核膜，因此非常適合核抗原檢測。但應該注意的是，如果在高濃度下使用或者作用時間過長，它們將破壞蛋白，從而影響實驗結果。Triton X-100是最常用的通透劑，但是它將破壞細胞膜，因此不適用于細胞膜相關抗原。后面一組去垢劑要溫和得多，它們可以在細胞質膜上形成足夠大的孔隙以允許抗體通過，但是不會溶解細胞質膜。適于胞質抗原或者質膜上靠近胞質一面的抗原，也適于可溶性的核抗原。

 
一般的操作程序是先固定后通透，但針對有些水不溶性的目的抗原的檢測宜先通透再固定，這樣做的原因主要是可以通過通透去除許多水溶性的蛋白，從而大大減少了免疫熒光的背景和非特異性信號。固定后以冷PBS液漂洗，最后以蒸餾水沖洗，防止自發性熒光。
 
（三）封閉
 
封閉的目的是為了減少抗體的非特異性結合，最常用的封閉劑為1% BSA, PBS pH 7.5,其他可選擇的封閉劑還有 1% gelatin, 1%bovine 或與二抗種屬相同的血清（3-10%）等。
 
（四）抗體孵育
 
直接免疫熒光法中的一抗和間接免疫熒光法中的二抗都是熒光抗體，因此在這些抗體孵育的時候必須注意避光。此外，為保證結合質量和防止干燥，抗體孵育應盡量在濕盒中進行。
 
（五）封片及熒光觀察
 
標記好熒光的細胞片原則上可以直接進行觀察，特別是有時候封片不當反而使得前功盡棄。但在絕大多數情況下，為了保存結果，以便進一步觀察、照像、統計分析等，需作封片處理。常規的方法是采用甘油或中性樹脂封片，為了增強封片的效果，往往需要在封片時添加特殊的抗熒光淬滅劑。
 
（六）標本保存
 
由于熒光色素和蛋白質分子的穩定性都是相對的，因此隨著保存時間的延長，在各種條件影響下，標記蛋白可能變性解離，失去其應有的亮度和特異性。因此給標本的保存帶來一定的困難，所以在標本進行熒光染色之后應立即觀察。由于性能良好的抗熒光淬滅劑的出現，熒光標記的標本可以在低溫（4℃或-20℃）下保存相當長的時間。在某些情形下，考慮到實驗的成本及實驗條件，也可以采取權宜的辦法，比如固定標本片后低溫保存，在需要時再進行熒光標記，即隨用隨染。