全國ctDNA基因突變檢測室間質量評價調查活動結果報告

　　二O一六年十一月，國家衛生計生委臨床檢驗中心發布了2016年全國腫瘤游離DNA（ctDNA）基因突變檢測室間質量評價調查活動結果報告。內容如下。

　　腫瘤游離DNA（ctDNA）基因突變檢測對腫瘤靶向治療、早期治療應答評估和耐藥監測的實時評估等都具有一定的臨床應用價值。由于組織樣本的局限性，臨床上逐漸開始使用患者血漿中的游離DNA進行腫瘤基因突變的檢測。

　　為了解我國臨床實驗室ctDNA基因突變檢測的開展現狀及質量狀況，國家衛生計生委臨床檢驗中心（以下簡稱“臨檢中心”）現開展該項目室間質量評價的預研，并要求各臨床實驗室使用日常所用試劑和程序進行檢測。本次質評具體情況如下：

　　一、樣本情況

　　1. 基本情況

　　本次共發放12個質評樣本，編號分別為1601、1602、1603、1604、1605、1606、1607、1608、1609、1610、1611、1612。為已提取的血漿游離DNA，游離DNA濃度為3~5ng/μl，樣本量為25μl。

　　16NC號樣本，為已提取的人基因DNA，代表臨床上來自患者外周血或者正常組織樣本中提取的基因組DNA，濃度30~50ng/μl，樣本量25μl。

　　12個質評樣本中，進行評價的樣本為10個，分別為：1601、1602、1603、1604、1606、1607、1609、1610、1611、1612。

　　2. 關于不評價樣本的說明

　　游離DNA檢測及質評樣本制備較為復雜，本次質評樣本涉及點突變、短片段缺失、插入、融合基因和拷貝數變異，對不同的突變類型，采用多種技術方案進行制備。融合基因中僅采用CRISPR/Cas9編輯的EML4 exon6-ALK exon20 fusion和EML4 exon20-ALK exon20 fusion突變作為評價樣本，采用其它技術方案制備的融合基因突變不納入本次PT成績評價。

　　為了解實驗室目前檢測游離DNA中基因突變的最低檢測下限，質評樣本中突變等位基因百分比約在0.1%~8%。根據實驗室回報結果的情況，本次質評中對等位基因百分比低于0.5%的突變不予評價。

　　1605和1608號為干擾樣本，不納入本次PT成績評價。

　　3. 質評樣本突變等位基因百分比的定值

　　由于目前沒有基因突變等位基因百分比定量的“金標準”方法，預期結果中采用如下方法來確定等位基因百分比：

　　（1）質評樣本制備時，突變基因和野生基因混合時，有預期濃度范圍；

　　（2）臨床實驗室回報的結果中，如該突變有5個以上數字PCR定值結果，采用數字PCR結果的中位數（中位數應在樣本制備的預期濃度范圍內）；如沒有足夠的數字PCR定值結果，采用NGS結果的中位數（中位數應在樣本制備的預期濃度范圍內）。

　　4. 預期結果

　　本次評價的基因突變，具體信息見表1。

　　二、檢測項目和要求

　　1. 本次質評的檢測項目是腫瘤游離DNA（ctDNA）基因突變檢測。

　　2. 本次室間質量評價調查活動在向每個參加實驗室發送檢測樣品的同時，附有給實驗室的活動說明“2016年全國腫瘤游離DNA（ctDNA）基因突變檢測室間質量評價調查活動安排及注意事項”、 “2016年全國腫瘤游離DNA（ctDNA）基因突變ARMS和數字PCR檢測室間質量評價調查活動回報表”以及“2016年全國腫瘤游離DNA（ctDNA）基因突變高通量測序檢測室間質量評價調查活動回報表”。

　　三、實驗室回報結果情況

　　共計有74家實驗室回報質評結果，共計收到結果74份，其中有效結果68份（即回報結果完整、在截止日期內回報的結果、提交原始數據的結果）。

　　本次質評中所有實驗室使用的方法，包括高通量測序、ARMS和數字PCR法。

　　四、評價原則

　　“腫瘤游離DNA（ctDNA）基因突變檢測”室間質量評價的評價原則如下：

　　由于本次質評中全部為臨床意義明確的位點，報告錯誤突變位點將對臨床決策造成重大影響，因此檢測的錯誤僅包括假陰性結果和假陽性結果兩種情況。

　　1. 假陰性結果：在檢測范圍內基因突變均要求正確報告，未報告即為假陰性結果。

　　2. 假陽性結果：預期結果（表1）以外的基因突變結果報告，均為假陽性結果。

　　3. PT成績計算：10個質評樣本，每個樣本10分，滿分100分。每個樣本參評實驗室檢測結果與預期結果完全相符，即為10分，不相符，即為0分。

　　4. 合格的判定標準：室間質量評價主要是計算參評實驗室對質評樣本的測定結果與預期結果的符合程度，根據符合率來判斷參評實驗室的能力是否合格（合格標準為大于等于80%）。定性結果根據參評實驗室陰陽性結果與預期結果是否符合，計算符合率。對檢測項目的評價為：（某項目測定結果可接受樣本數/某項目樣本總數）×100＝本次某項目測定得分，如果該項目得分大于等于80%則為合格。未按時回報結果者判為不合格，該次得分為0分。

　　五、 PT成績情況

　　PT成績合格的實驗室，發放質評合格證書，高通量測序法合格證書中注明實驗室的檢測突變類型和檢測方法；ARMS和數字PCR法合格證書中注明實驗室的檢測基因和檢測方法。

　　PT成績不合格的實驗室，發放質評參加證書；

　　如實驗室回報結果不完整、或未在截止日期內回報結果、或未提交原始數據文件，按照未參加本次質評對待。

　　本次質評中，實驗室PT成績情況見表2。

　　六、各樣本的結果統計

　　各質評樣本的實驗室符合率，假陽性實驗室數和假陰性實驗室數見表3。

　　注：部分實驗室同時存在假陽性和假陰性結果。

　　七、對本次質評調查活動的說明

　　本次室間質評樣本主要包含非小細胞肺癌靶向相關的基因突變，突變等位基因百分比約在0.1%~8%。本次質評評價的是實驗室進行ctDNA基因突變檢測能力。

　　盡管本項目質評樣本采用的是已提取的游離DNA，但需要強調的是，血漿游離DNA提取對腫瘤游離DNA檢測非常重要，由于DNA片段化，不同的提取試劑對小片段DNA的結合效率差別很大，因此不同試劑提取游離DNA效率存在很大差異，實驗室應對提取效率進行充分評價。本次質評僅對腫瘤游離DNA檢測的質量進行實驗室間比對，而未能涵蓋核酸提取過程。

　　本次質評，共計有74家實驗室回報質評結果，共計收到結果74份，其中有效結果68份（即回報結果完整、在截止日期內回報的結果、提交原始數據的結果）。結果無效的主要原因是部分實驗室未提交原始數據，此外，還存在以下情況：實驗室提交的原始數據中與回報結果有明顯不符（例如，vcf文件中沒有出現回報結果中的突變）、現場數據分析結果突變位點頻率與回報結果中相差較大、不同實驗室原始數據結果均來源于同一測序儀等。希望將來各臨床實驗室能報告真實檢測結果，我們在以后的正式質評中，也將視情況采取要求提交原始數據及現場檢查的方式來監測實驗室回報結果的真實性。

　　實驗室回報的方法學包括NGS、ARMS和數字PCR，回報的實驗室百分比分別為63.2%（43/68）、20.6%（14/68）和16.2%（11/68）。實驗室總體檢測情況良好，符合率為82.4%（56/68），50%的實驗室PT成績為100分。其中，采用數字PCR法的實驗室符合率100%（11/11），高于NGS [79.1%（34/43）]和ARMS方法[78.6%（11/14）]。

　　錯誤的情況包括假陰性結果和假陽性結果兩個方面。

　　1. 假陰性結果：盡管本次質評要求實驗室報告最低檢測下限，且從理論上說，可只要求實驗室檢出突變等位基因百分比高于最低檢測下限的樣本。但是，這種做法只適用于實驗室定量報告可比性良好的情況。

　　從本次實驗室回報結果情況來看，目前各實驗室，特別是NGS法，實驗室報告的突變等位基因百分比完全沒有可比性。例如，對融合基因，實驗室A和B報告的突變百分比其設定的最低檢測下限分別為1%和0.05%，但是對1611號樣本EML4 exon6-ALK exon20 fusion （預測結果中突變百分比0.50%），均報告陽性，突變百分比分別為6.65%和0.75%。因此對實驗室A，如果允許突變百分比低于0.50%的樣本可不檢出，顯然是不合適的。

　　本項目質評要求，等位基因百分比≥0.5%的突變均應檢出，在此基礎上，在檢測范圍內基因突變均要求正確報告，未報告即為假陰性結果。實驗室報告的假陰性結果主要分布在19del（突變百分比2.32%）、20插入（突變百分比1%）以及融合基因（突變百分比0.5~1%），ARMS出現1個假陰性結果，數字PCR法沒有報告一例假陰性結果，所有突變中，NGS實驗室在20插入突變的假陰性率最高，為16.3%（7/43）。

　　2. 假陽性結果：假陽性結果是本次質評中實驗室錯誤的最主要原因，且具有明顯的隨機性。例如，1603和1609為重復樣本，假陽性率分別為26.5%（18/68）和5.9%（4/68）。1609號樣本中出現2例G12D假陽性結果，而1603號完全沒有G12D的假陽性結果。實驗室報告的假陽性結果，有臨床常見的突變，例如T790M，V600E, G719D，還有較少見的突變，例如，NM_001163213.1(FGFR3): c.685G>A(p.Val229Ile)、NM_000251(MSH2):c.107delT(p.L36fs)、NM_000400 (ERCC2):c.G335A(p.R112H)等。實驗室假陽性的原因通常包括：實驗室污染、操作交叉污染（比如1603號樣本為19del陽性，而實驗室在1602號報告19del假陽性結果）、弱陽性樣本和非特異擴增曲線的判斷、NGS檢測錯誤，未進行完全的背景過濾等。在臨床檢測中，突變的陽性率遠低于室間質評的樣本，假陽性的風險可能相對降低，但是，由于游離DNA檢測的敏感性高于組織樣本的檢測，如何避免實驗室污染的影響、如何區別弱陽性和假陽性結果仍然是實驗室面臨的困難之一。

　　八、成績為100分的實驗室

　　九、致謝

　　感謝Thermo Fisher公司對游離DNA提取給予的大力支持，感謝天津華大醫學檢驗所、南京世和醫學檢驗所、北京貝瑞和康醫學檢驗所為本次室間質評樣本制備過程中完成的部分協助驗證工作。

　　全國腫瘤游離DNA（ctDNA）基因突變檢測室間質評證書將于2017年1月5日發放。