關于土壤基因組DNA提取

土壤樣品含有大量的微生物，其中絕大部分的微生物都是無法直接培養進行繁殖和研究。從土壤樣品中提取 DNA 是研究土壤微生物zui為有效的方法。目前從土壤樣品中提取微生物 DNA 的方法主要有直接法和間接法。直接法是指把土壤樣品放在裂解液中，經過有效的破壁方法使微生物的DNA 全部釋放到裂解液中，然后再進行分離提取，如 Zhou 的方法。間接法是指將土壤放在一種的緩沖液中，如 Buffer PBS 等，把微生物從土壤中分離出來，然后再進行 DNA 的提取。間接法可大大降低土壤中腐殖酸，重金屬鹽對 DNA 提取帶來的影響，但是這種方法會丟失許多微生物，得到的 DNA 并非土壤樣品中的全基因組 ( 宏基因組 ) ，目前已經很少研究者會采用這種方法。從土壤樣品中直接提取 DNA 可zui大可能性地獲得全基因組，但是這種方法卻面臨以下幾個問題：    

1.腐殖酸的污染。土壤中，特別是森林，草地土壤含有非常豐富的腐殖酸。腐殖酸是一系列的有機物分子，部分分腐殖酸同核酸分子非常類似，在純化過程中非常難于去除。微量的腐殖酸污染都會導致下游應用，如 PCR ，酶切的失敗。    

2.裂解方法。土壤樣品中含有各種微生物，如細菌和真菌等。革蘭氏陽性細菌和真菌都含有非常厚的細菌壁，讓這些微生物的細胞壁有效破裂是提取高產量宏基因組 DNA 的關鍵。由于土壤樣品的復雜性，使用酶法 ( 如溶菌酶，破壁酶，蝸牛酶 ) 或液氮研磨都不可行，因為土壤中含有各種金屬離子或抑制因子導致消化酶的活性失活，或土壤中的沙粒等會導致液氮研磨很難進行。    

3.DNA 得率難于控制。土壤樣品或因肥沃，或因貧瘠，或因含水量豐富，或因干枯，或因取樣的深淺度，都會造成微生物數量和品種發生劇烈改變。在一個小范圍的土壤樣品 DNA 含量往往會差別成千上百倍。此外，某些土壤中含有的化學成分，如重金屬鹽，粘土物質都會造成DNA 得率降低。    

Omega Biotek 公司的 E.Z.N.A. Soil DNA Kit 是目前土壤 DNA 提取zui為優化的試劑盒。該試劑盒采用玻璃珠研磨法和熱激化學破壁法，可不需特殊的珠磨儀，在點動渦旋儀就可進行，適合于廣大的研究室。試劑盒中 HTR Reagent 是 Omega Biotek 公司開發的腐殖酸吸附劑，能高效去除各種腐殖酸的污染。此外還采用無醇的硅膠柱純化方式，可高效去除土壤中各種可溶性金屬鹽，以及其它可溶性的抑制因子。該試劑盒已經成功地提取如下土壤 ( 部分是客戶反饋 ) ：自然保護區森林的土壤 ( 長達 30-40 年森林土壤，表層有 30 -1250px 落葉層 ) ，紅樹林土壤，草地，耕地，海底泥，污泥，礦石區泥土，有機物污染的泥土，池塘泥，垃圾泥，空調管道堆積物等。    

實驗方法    

為表明該試劑盒的優勢性，我們選擇以下不同組織樣品進行 DNA 提取實驗，每個樣品重復 3 次。    

森林類樣品：自然保護區森林土壤 ( 廣東黑石頂自然保護區 ) 和海南島紅樹林保護區    

礦石區樣品：礦石區水底土壤 ( 濕 ) 和礦石區地表土壤 ( 干 )    

耕地樣品：稻田土壤，菜地土壤    

有機物污染地表樣品：污水溝衍泥和生活垃圾堆放區    

操作方法（按 Soil DNA Kit 試劑盒進行）簡單描述以下：    

1.取▲ 0.5 g 森林土壤 / 耕地土壤 ，或 ◆ 4g 礦石區土壤和有機物污染土壤至 15ml 離心管中；    

2.加入▲ 0.5g 酸洗玻璃珠，或 ◆ 4g 酸洗玻璃珠；    

3.加入▲ 1ml Buffer SXL MLus ，或 ◆ 8 ml Buffer SXL MLus ；    

4.立即在渦旋儀上zui高速渦旋 3 分鐘。    

5.加入▲ 100ul   ，或◆ 800ul Buf fer DS ，渦旋 15s 混勻    

6.轉移至預熱至 70 ^oC 水浴鍋中，水浴 10-15 分鐘。    

7.3000 x g 離心 3 分鐘，轉移▲ 800ul ，或◆ 7 ml 上清，并加入▲ 270ul Buffer SP2 或◆ 2.3 ml Buffer SP2 ，渦旋混勻；    

8.▲ 10,000 x g 離心 5 分鐘，或 ◆ 5 ， 000 x g 離心 10 分鐘；    

9.把上清液轉稱至新的 2ml/15ml 離心管中，加入 0.7 倍的異丙醇。 ( 在處理礦石區樣品時和有機物污染的樣品中，還加入 133ul 糖原溶液 )，渦旋混勻；    

10.▲ 10,000 x g 離心 5 分鐘，或 ◆ 5 ， 000 x g 離心 10 分鐘沉淀收集 DNA 。    

11.倒棄上清液，并反扣于吸水紙上 5 分鐘；    

12.加入 200 ul Elution Buffer ，渦旋 5 秒。 6 5 ℃ 水浴 20-60 分鐘，讓 DNA 充分溶液。    

13.加入 50ul HTR, 反應 2min 后，離心，取上清。    

14.上清加入等體積（約 200ul ） XP2 Buffer ，均勻后上柱。    

15.加入 300ul XP2 Buffer ，洗滌一次。    

16.加入 700ul SPW Wash Buffer ，洗滌兩次。    

17.空甩后，加入適當量的 Elution Buffer 洗脫即可。    

實驗結果    

1.  DNA 電泳結果    

取 10 ul 純化的基因組 DNA 上樣于 0.8% 瓊脂糖凝膠， 80V 電泳 30 分鐘，結果如下。    

0.5g 森林類土壤樣品    

( 前兩個自然保護區森林土壤，后兩個為紅樹林土壤 )    

0.5g 耕地類土壤樣品    

A: 水稻田土壤    

B: 玉米土壤    

4g 有機物污染土壤樣品    

A: 生活垃圾堆放地    

B: 污水溝底泥    

4g 礦石泥    

1 和 3 是兩個礦石區水底土壤 ( 濕 )    

2 和 4 礦石區地表土壤 ( 干 )    

2.        DNA 純度和產量分析