關于目的基因組DNA片段的制備的介紹

　　按照常規方法從作為供體的生物細胞中分離純化其染色體DNA，在一般條件下，由于分離純化操作中的物理剪切作用，制備出的染色體DNA片段平均大小在10～-200kb左右。然后將染色體DNA用下列方法切成片段，以便與載體分子進行體外重組 [1]。

　　(1)機械切割。供體染色體DNA可用機械方法(如超聲波處理等)隨機切割成雙鏈平頭片段，采取合適的超聲波處理強度和時間可將切割的DNA片段控制在一定范圍內，其上限為載體的最大裝載量，而下限應大于目的基因的長度，否則無法在一個重組克隆中獲得完整的目的基因。一胺來說，原核生物的基因長度大都在2kb以內，真核生物的基因長度變化很大，最大的基因可達1001kb以上，因而將外源DNA片段處理成略小于載體裝載量上限的長度始終是正確的，因為每個重組克降中所含的外源DNA片段越大，后續選的規模就越小。當染色體DNA上目的基因區域的限制性酶切圖譜未知時，機被切割是制備待克隆DNA片段的首選方法，但由于這些DNA片段具有隨機平頭末端，因此必須插入載體DNA的平頭限制性酶切位點上，而且克隆的外源DNA片段很難完整地從重組分子上卸下。

　　(2)限制性內切酶部分解。采用識別序列為四破基對的限制性內切酶(如MbolSaa3A、Alal等)部分降解染色體DNA，也可獲得大片段的DNA分子。由于這些限制性內切酶的識別順序在任何生物基因組中頻繁出現，因此只要采取合適的部分酶解條件同樣可以獲得一定長度的DNA隨機片段，而且經部分酶解獲得的DNA片段具有黏性末端，可以直接與載體分子拼接。

　　(3)特定限制性內切酶全酶解。如果染色體DNA中目的基因的兩側擁有已知的限制性內切酶識別位點，而且兩者之間距離不超過載體裝載量的上限，那么用這一種(或兩種)限制性內切酶全酶解染色體DNA片段可能更為有利，所產生的DNA片段呈非隨機性，在某些程度上可以簡化后續的重組和篩選操作。同時，重組分子可用相同的限制性內切酶完全切下插入片段，這使得利用限制性酶切圖譜法直接篩選目的重組子成為可能。