關于熒光顯微鏡原理及應用

熒光顯微鏡原理及應用
（一）熒光顯微鏡的原理和結構特點 ：熒光顯微鏡是利用一個高發光效率的點光源，經過濾色系統發出一定波長的光（如紫外光3650入或紫藍光4200入）作為激發光、激發標本內的熒光物質發射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。這樣在強烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認，敏感性高，主要用于細胞結構和功能以及化學成分等的研究。熒光顯微鏡的基本構造是由普通光學顯微鏡加上一些附件（如熒光光源 、激發濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等）的基礎上組成的。熒光光源——般采用超高壓汞燈（50一200W），它可發出各種波長的光，但每種熒光物質都有一個產生zui強熒光的激發光波長 ，所以需加用激發濾片（一般有紫外、紫色、藍色和綠色激發濾片），僅使一定波長的激發光透過照射到標本上，而將其他光都吸收掉。每種物質被激發光照射后，在極短時間內發射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷（或壓制）濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發光進入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛，二是選擇并讓特異的熒光透過，表現出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。
熒光顯微鏡就其光路來分有兩種：
1．透射式熒光顯微鏡: 激發光源是通過聚光鏡穿過標本材料來激發熒光的。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調節反光鏡使激發光轉射和旁射到標本上．這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優點是低倍鏡時熒光強，而缺點是隨放大倍數增加其熒光減弱．所以對觀察較大的標本材料較好。
2．落射式熒光顯微鏡這是近代發展起來的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個雙色束分離器，它與光鈾呈45。角，激發光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發光同時進入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發光和熒光分開，殘余激發光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應產物的需要。此種熒光顯微鏡的優點是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數愈大熒光愈強。

熒光顯微鏡使用注意事項：
1、 嚴格按照熒光顯微鏡出場說明書要求進行操作，不要隨便改變程序。
2、 在暗室中進行檢驗。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5~15min，待光源發出強光并穩定后，眼睛完全適應暗室，再開始觀察標本。
3、 防止紫外線對眼睛的傷害，再調整光源時，應帶上防護眼睛。
4、 檢查時間以一次1-2hrs為宜，如果超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3~5min后，標本熒光也明顯減弱；所以zui多不要超過2~3hrs。
5、 熒光光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應打開電扇或空調散熱降溫。換新燈泡應從開始使用就記錄時間。等熄滅后欲在使用，待燈泡充分冷卻后才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。
6、 標本染色后立即觀察，時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本保存在聚乙烯塑料袋中4度保存，可延緩熒光減弱時間。
7、 熒光強度的判斷標準；一般分為四級，1： 無或可見微弱熒光，2：僅能見明確可見熒光，3：可見有明亮的熒光，4：可見耀眼的熒光。