興奮性神經遞質谷氨酸轉運蛋白配體結合模式的結構基礎

　　中樞神經系統中，谷氨酸（Glutamate）是含量最高、分布最廣的興奮性神經遞質，通過激活突觸后膜谷氨酸受體，參與大腦的學習和記憶等功能。突觸間隙中興奮性谷氨酸水平必須受到嚴格調節，以避免谷氨酸受體過度刺激導致的谷氨酸興奮性毒性。表達于星形膠質細胞質膜上的興奮性谷氨酸轉運蛋白2（hEAAT2）利用轉運離子的跨膜電化學梯度和膜電位為驅動力，將突觸間隙中約90%谷氨酸轉運到細胞中進行清除。hEAAT2屬于SLC1A家族蛋白，具有谷氨酸轉運和介導陰離子電導的雙重功能。該蛋白功能失調或障礙時，可導致癲癇、帕金森病、發作性共濟失調和肌萎縮側索硬化癥等多種神經系統疾病，是重要的藥物治療靶標。目前，尚無以此類蛋白（EAATs）為治療靶標的藥品上市。因此，對hEAAT2蛋白配體結合模式的闡釋，將對治療hEAAT2相關神經系統疾病具有重要意義。

　　6月9日，中國科學院生物物理研究所趙巖課題組、東北農業大學生命科學學院姜巨全課題組與北京大學藥學院黃卓課題組合作，在《自然-通訊》（Nature Communications）上，發表了題為Structural basis of ligand binding modes of human EAAT2的研究論文。該研究報道了兩個分辨率均為3.4?的hEAAT2結合天然底物Glutamate（hEAAT2^Glu）或抑制劑WAY-213613（hEAAT2^W）的復合物結構（圖1），闡明了hEAAT2配體結合的結構基礎。研究結合電生理技術，驗證了氨基酸殘基S441^HP2對Glutamate和抑制劑結合具有重要作用；鑒定出I464-L467-V468殘基簇是抑制劑WAY-213613高選擇性結合hEAAT2的結構基礎。

　　在hEAAT2^Glu結構中，Glutamate與其周圍廣泛而保守殘基參形成極性相互作用，其中包含殘基D475^TM8和R478^TM8（圖2a）。同時，蛋白HP2通過特異性殘基S441^HP2和S444^HP2與其他結構元件形成氫鍵，起到維持HP2關閉進而穩定Glutamate結合的作用。電生理實驗結果證明，氨基酸殘基D475^TM8和R478^TM8突變后突變體保留通道活性，但喪失Glutamate結合能力（圖2b）。當hEAAT2上特異的氨基酸殘基S441^HP2突變為同源蛋白保守的甘氨酸殘基后，突變體對Glutamate親和力比野生型提高了77倍（圖2c），推測該突變破壞了殘基維持HP2關閉的相互作用，從而促進Glutamate釋放，加速Glutamate轉運循環，致使hEAAT2偏向具有更高通道開放概率。

　　在hEAAT2^W復合物結構中，抑制劑WAY-213613通過極性或疏水相互作用（圖2d），占據谷氨酸相似的結合位點。氨基酸殘基D475^TM8、R478^TM8和S441^HP2與抑制劑形成極性或陽離子-π鍵相互作用穩定抑制劑結合（圖2b、2d）。同時，I464-L467-V468殘基簇對于WAY-213613高選擇性、高親和力結合hEAAT2頗為關鍵。電生理實驗證明，這些關鍵氨基酸的突變都顯著的降低WAY-213613對hEAAT2的抑制作用（圖2e-f）。這些結構信息闡明了hEAAT2的配體結合模式，為未來藥物的設計和開發奠定了結構基礎。

　　研究工作得到國家腦科學與類腦智能技術項目、中科院戰略性先導科技專項、國家重點研發計劃、國家自然科學基金、生物物理所生物大分子國家實驗室開放課題等的支持。生物物理所生物成像中心為本研究提供了設備和技術支持。

　　論文鏈接 

圖1.hEAAT2蛋白功能表征和整體結構。（a）野生型hEAAT2陰離子電流的Glutamate濃度依賴的激活曲線；（b）野生型hEAAT2陰離子電流的WAY-213613濃度依賴的抑制曲線；（c）hEAAT2三聚體細胞質側視圖。

圖2.hEAAT2蛋白配體結合位點及關鍵氨基酸殘基功能驗證。（a）hEAAT2^Glu結構中參與Glutamate結合殘基；（b）突變體D475A^TM8、R478A^TM8和S441G^HP2陰離子電流的WAY-213613濃度依賴的抑制曲線；（c）突變體S441G^HP2陰離子電流的Glutamate濃度依賴的激活曲線；（d）hEAAT2^W結構中參與WAY-213613結合殘基；（e）突變體（I464V^TM8、L467I^TM8和V468I^TM8）陰離子電流的Glutamate濃度依賴的激活曲線；（f）突變體（I464V^TM8、L467I^TM8和V468I^TM8）陰離子電流的WAY-213613濃度依賴的抑制曲線。