冷凍蝕刻電鏡技術操作方法

操作方法

冷凍蝕刻的操作方法按以下步驟進行。

1.預處理取新鮮組織塊，大小為15~3~5mm，用25%戊二醛固定1~3小時。為防止冰晶形成，用30%甘油生理鹽水浸泡8~12小時。

2.冷凍斷裂是在冷凍條件下使樣品變得又硬又脆，用刀劈裂樣品，暴露觀察面。因為是用刀劈裂的樣品，斷裂往往發生在細胞被凍結后較脆弱的部位，多數是沿細胞及細胞器的膜裂開。由于斷裂面是凸凹不平的，所以圖像立體感強。冷凍斷裂時，刀的作用在于劈裂，而不是切割，所以刀刃不必鋒利，但不能有缺口、油污和水份，還需保持清潔干燥。冷凍復型的斷裂操作要在真空中進行，是因為真空對熱傳導性差，能使樣品較長時間維持在較恒定溫度下進行斷裂操作，同時也便于進行下步的蝕刻處理。儀器中進行斷裂的最佳條件:真空度為133×10-5~3×40-3Pa(1×10-5~3×10-5Torr)，樣品升溫至-100℃~-110℃。

3.蝕刻就是在真空中使冷凍樣品表面上的冰升華。目的是為了暴露出樣品斷裂面上的超微結構，便于噴鍍。一般認為最佳蝕刻深度約為30nm。若蝕刻深度不夠，結構被冰掩蓋不能充分暴露出來，圖像模糊;若蝕刻深度過大，超微結構因其基礎支持不足而倒塌，從而破壞了超微結構。蝕刻深度是由蝕刻速度和蝕刻時間決定的，而蝕刻速度是受真空度、溫度、水蒸汽壓所影響。一般蝕刻條件:真空度為133×10-3~133×10-4Pa(10-5~10-6 Torr)，溫度降至-100℃，在此條件下，蝕刻速度大約為2nm/s。

4.噴鍍即在樣品斷裂面上噴鍍一層鉑膜及碳膜。鉑膜厚度為2~5nm。為使圖像具有立體感，噴鉑的方向與樣品成45度角。為加固鉑膜強度，再噴鍍一層碳，噴碳的方向與樣品面成90度角。

5.剝離清洗噴鍍后，將樣品取出放入10~30%次氯酸鈉腐蝕液中，樣品漸冒氣泡并與復型膜分離。隨后用蒸餾水仔細清洗復型膜。

6.撈膜將清洗后的復型膜撈在不加支持膜的400目載網上，待干后電鏡觀察。