凝膠層析法分離蛋白質原理

　　所謂層析，就是利用樣品中各組成成分的理化性質的差異，使各組分以不同程度分布在固定相和流動相兩相中，由于各組分隨流動相前進的速率不同，從而把它們分離開來的技術。這些物理特性包括分子的大小、形狀、所帶電荷、揮發性、溶解性及吸附性質等。層析系統的必要組分有：

　　a. 固定相，可以是一種固體、凝膠或固定化的液體

　　b. 層析床，把固定相填入一個玻璃或金屬柱中，或者薄薄涂布一層于玻璃或塑料片上或者吸附在醋酸纖維紙上。

　　c. 流動相，起溶劑作用的液體或氣體

　　d. 運送系統，用來促使流動相通過層析床。

　　e. 檢測系統，用于檢測試管中的物質。

　　由于不同物質固定相相互作用的強弱不同，從而使得分離目的得以實現。

　　要點：層析系統中，與固定相作用強的物質受到的阻力最大，而作用弱的物質受到的阻力很小，因而不同物質在層析過程中的遷移距離和洗脫時間不同。

　　介紹凝膠層析的概念。凝膠層析又稱分子篩層析，主要根據混合物中分子的大小和形狀不同 ，在通過凝膠時，分子的擴散速率各異而達到分離的目的。凝膠顆粒具有多孔性網狀結構，小分子易進入凝膠網孔，流程長而移動速度慢，而大分子物質不能進入凝膠網孔，沿凝膠顆粒間隙流動，流程短移動快。這種現象稱為分子篩效應。

　　在凝膠層析中常用的凝膠有葡聚糖凝膠(商品名Sephadex)、聚丙烯酰胺凝膠(Bio-Gel-P)和瓊脂糖凝膠(Agarose)。葡聚糖凝膠是由細菌葡聚糖(又稱右旋糖苷)在糖的長鏈間用交聯劑1-氯-2，3-環氧丙烷交聯而成。在合成時，調節葡聚糖和交聯劑的比例，可以獲得具有網孔大小不同的凝膠。G值表示交聯度，G值愈大，交聯度愈小，網孔和吸水量越大。

　　本實驗通過SephadexG50層析柱，以蒸餾水為洗脫劑，分離血紅蛋白(紅色，分子量約64500)與硫酸銅(藍色，分子量249.5)的混合物，從顏色的不同可觀察到血紅蛋白洗脫快，硫酸銅洗脫較慢。