凝膠層析法脫鹽和分離蛋白質

（一）原理

凡鹽析所獲得的粗制蛋白質（鹽析得到的IgG）中均含有硫酸銨等鹽類，這類將影響以后的純化，所以純化前均應除去，此過程稱為“脫鹽”（desalthing）。脫鹽常用透析法和凝膠過濾法，這兩種方法各有利弊。前者的優點是透析后析品終體積較小，但所需時間較長，且鹽不易除盡；凝膠過濾法則能將鹽除盡，所需時間也短，但其凝膠過濾后樣品體積較大。所以，要根據具體情況選擇使用。前實驗中樣品體積較小，凝膠達濾后樣品體積不會太增加，所以選用凝膠過濾法。

（二）試劑與器材

（1）Sephadex G-25。

（2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液。

（3）奈氏（Nessler）試劑：于500ml錐形瓶內加入碘化鉀150g，碘110g，汞150g及蒸餾水100ml。用力振蕩7～15min，至碘的棕色開始轉變時，混合液溫度升高，將此瓶浸于冷水內繼續振蕩，直到棕色的碘轉變為帶綠色的碘化鉀汞液為止。將上清液傾入2000ml量筒內，加蒸餾水至2000ml，混勻備用。

（4）20%（W/V）磺基水楊酸溶液。

（5）1.5cm×20cm層析柱。

（6）黑、白比色磁盤。

（三）操作

（1）取層析柱1支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，關閉下端出口。將已經溶脹好的Sephadex G-25中的水傾倒出去，加入2倍體積的0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并攪拌成懸浮液，然后灌注入柱，打開柱的下端出口，繼續加入攪勻的Sephadex G-25，使凝膠自然沉降高度到17cm左右，關閉出口。待凝膠柱形成后，在洗脫瓶中加入0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液以3倍柱體積的磷酸鹽緩沖流過凝膠柱，以平衡凝膠。

（2）凝膠平衡后，用皮頭滴管除去凝膠柱面的溶液，將鹽析所得全部IgG樣品加到凝膠柱表面，打開柱下口，控制流速讓IgG樣品溶液慢慢浸入凝膠內。凝膠柱面上加一層的0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并用此緩沖液洗脫，控制流速為0.5ml/min左右。用試管收集洗脫液，每管10滴。

（3）在開始收集洗脫液的同時檢查蛋白質是否已開始流出。為此，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盤中，加入1滴20%磺基水楊酸，若呈現白色絮狀沉淀即證明已有蛋白質出現，直到檢查不出白色沉淀時，停止收集洗脫液。

（4）由經檢查含有蛋白質的每管中，取1滴溶液，放置在白色比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑，若呈現棕黃色沉淀說明它含有硫酸銨。合并檢查后不含硫酸銨的各管收集液，即為“脫鹽”后的IgG。

注意：在檢測時，用皮頭滴管吸取管中溶液后應及時洗凈，再吸取下一管，以免造成相互污染假象。