蛋白質是由氨基酸以“脫水縮合”的方式組成的多肽鏈經過盤曲折疊形成的具有一定空間結構的物質。蛋白質中一定含有碳、氫、氧、氮元素,常見的蛋白質檢測方法很多。
1、凱氏定氮法
準備4個50mL凱氏燒瓶并標號,想1、2號燒瓶中加入定量的蛋白質樣品,另外兩個燒瓶作為對照,在每個燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物,再加入濃硫酸,將4個燒瓶放到消化架上進行消化。
消化完畢后進行蒸餾,全部蒸餾完畢后用標準鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量,直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色,即為滴定終點,結算出蛋白質含量。
2、雙縮脲法
雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法,硫銨不干擾顯色, Cu2+與蛋白質的肽鍵,以及酪氨酸殘基絡合,形成紫藍色絡合物,此物在540nm波長處有最大吸收。
利用標準蛋白溶液和雙縮脲試劑繪制標準曲線,將待測血清與硫酸鈉在待測試管中混合,并只加入硫酸鈉不含血清的試管作對照,將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑,混合后于37℃環境中放置10分鐘,在540nm波長進行比色,以對照管調零,讀取吸光度值,標準曲線上直接查出蛋白質含量。
3、酚試劑法
取6支試管標號,前5支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液,最后一支試管加待測蛋白質溶液,不加標準蛋白溶液,每支試管液體總量加入蒸餾水補足而保持一致,混合均勻,在室溫下放置30分鐘,以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照,于650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。
4、紫外吸收法
大多數蛋白質在280nm波長處有特征的最大吸收,這是由于蛋白質中有酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸存在,可用于測定0.1~0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。
取9支試管分別標號,前8支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液,1號試管不加標準蛋白溶液,最后一支試管加待測蛋白質溶液,而不加標準蛋白溶液,每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致,將液體混合均勻,在280nm波長處進行比色,記錄吸光度值。
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