FDA是QbD概念最積極的倡導者和推動者。為了使色譜技術得到更好的發展，美國FDA要求利用QbD(質量源于設計)理念制定針對色譜技術的系統實驗計劃，以取代目前仍被廣泛使用的試錯法。
本文作者Hans-Werner Bilke為HPLC技術服務專家;Stefan Moser為過程最佳化技術專家。
圖1.尋找最佳工作點時的單純性值分析評估;最佳工作點有關數據：梯度時間tG=38.3分鐘、溫度T=30.1攝氏度、乙腈中的甲醇三元提取劑成分tC=4.0%、初始濃度%Bs=5.7%、最終濃度%Be=90%、酸堿度PH值=2.9、流動系數F=1.4ml/分、滯留容積=1.06ml。
21世紀初，美國推出QbD(質量源于設計)理念。QbD(Quality by Design，)，其定義是：在可靠的科學和質量風險管理基礎之上的，預先定義好目標并強調對產品與工藝的理解及工藝控制的一個系統的研發方法。質量不是通過檢驗注入到產品中，而是通過設計賦予的。而良好的設計，得益于對產品的認知和對生產的全過程控制。
確定方法的穩定耐用性、整體最佳性是新分離技術研發的基礎。所以研發人員需要對液相色譜技術有更深入的理解，以便定義方法的設計空間。
在高效液相色譜法的設計空間中，方法學中的許多參數都要滿足規定的色譜分析任務所帶來的風險性要求。為了能夠可靠的估計設計空間，就需要有高數據質量和一套完整的結構模式。
QbD包括質量風險管理、平臺、設計空間、和過程分析技術。在DoE統計軟件的幫助下，可以通過相對較少次數的嘗試模擬HPLC法中存在的問題。另外，利用此法也能滿足當局對經久耐用的穩定工作點、工作范圍的高可靠性評估要求。
基于經驗的過程模型和統計學的試驗方法
液相色譜分離過程的質量與許多因素有關。如梯度時間(tG)、溫度(T)、三元提取劑成分(tC)、有機提取劑B、B的初始濃度(%Bs)和最終濃度(%Be)、水質提取劑A的酸堿度PH值以及流動系數(F)等都是重要的影響因素。對這些影響因素逐一逐步優化是非常費時費力的，而且得到的結果不一定是最佳優化條件。
在制藥生產領域中，用于藥品小分子分離的高效液相色譜技術實踐中，影響因素明顯多于3個(或達10個)，而且這些影響因素之間的相互作用會使得問題更為復雜。弄清楚這些因素之間的關系及相互作用，才能夠對高效液相色譜法進行整體性優化。在所有的峰值選擇性分離技術領域中，重要的目標值是關鍵分辨率Rskrit(色譜圖中最差被分離峰值的分辨率)以及色譜圖中最后一個峰值的停滯時間tRmax的最短化。
上述種種影響因素都屬于重要的質量標志;因此要在統計試驗SVP中利用方法學技術搞清楚。在實驗確定各個因素之前要確定各個參數變量的區間，也就是要設定實驗時參數取值的窗口。
在選定一個試驗計劃、或者說是選定一個試驗程序時，知道哪些參數在變量區間內會對試驗結果有影響是很有必要的，可以大大縮小需考慮的影響因素范圍，本文采用的是Rechtschaffner實驗設計。其允許測定所有的線性主效應、還會對可能的非線性進行二次逼近以及不將所有的交互影響交織在一起。
最佳的和穩定的分離工作點
為了找到HPLC高效液相色譜分離的工作點，一方面要在實驗中對所有的影響因素、變量在其取值區間內進行變化，另一方面也可能會得到多個優化的目標量。
最佳的工作點：是將所有目標量最佳化，再利用單純性算法語言來求解出來。此算法語言能夠同時改變所有變量參數，從而把實現目標值的試驗次數減少到最少，也能夠把接近目標值的級差間隔縮小到最小。
本文后續內容中將把這一觀念稱之為log(D)函數值。當log(D)函數值為零時，表示找到了這些參數的目標工作點。由于是同時從多個不同起點開始的單純性算法優化，因此也可以把log(D)函數值最小的一點確定為最佳工作點(見圖1)。以找到的最佳工作點為基礎，可以確定各個參數在所有參數區間內該參數與技術規范規定的極限值之間的(Manhatten)級差間隔，它表示的是最穩定的工作點。第一個設計空間是根據所選擇的參數和技術規范中給出的數據確定的。
確定最穩定工作點的運算次數要考慮所有的峰值和參數：
運算的次數=目標量的次數x分析因子參數的數量。當分析因子數量不多時(本例為7個，參數區間為8)，按照上式計算出來的運算次數就高達35651584次了;因此是一項耗時巨大的運算過程。
圖2.尋找最穩定工作點的FRS工具;最穩定工作點有關數據：梯度時間tG=31.4分鐘、溫度T=34.3攝氏度、乙腈中的甲醇三元提取劑成分tC=14.3%、初始濃度%Bs=5.7%、最終濃度%Be=91.4%、酸堿度PH值=3.0、流動系數F=1.4ml/分、滯留容積=1.06ml。
在圖2中給出了穩定工作點時的參數位置。HPLC高效液相色譜分離技術優化的結果匯總在表1中。兩個工作點的參數值梯度時間(tG)、溫度(T)、三元提取劑成分(tC)差異很大。目前還很難實現三維空間的設計空間。所做到的設計空間‘探索者’允許在此空間內進行二維投影。‘探索者’設計空間中找到的最穩定工作點用叉號表示(見圖3)。
圖3.最穩定優化的‘探索者’設計空間;為時間梯度tC和酸堿度PH值找到了最穩定的工作點。
圖4.最佳優化的‘探索者’設計空間;為時間梯度tC和酸堿度PH值找到了最穩定的工作點：梯度時間tG=38.3分鐘、溫度T=30.1攝氏度、乙腈中的甲醇三元提取劑成分tC=4.0%、初始濃度%Bs=5.7%、最終濃度%Be=90%、酸堿度PH值=2.9、流動系數F=1.4ml/分、滯留容積=1.06ml。
圖5.最穩定優化的‘探索者’設計空間;為時間梯度tC和酸堿度PH值找到了最穩定的工作點：梯度時間tG=31.4分鐘、溫度T=34.3攝氏度、乙腈中的甲醇三元提取劑成分tC=14.3%、初始濃度%Bs=5.7%、最終濃度%Be=91.4%、酸堿度PH值=3.0、流動系數F=1.4ml/分、滯留容積=1.06ml。
‘探索者’設計空間的界線考慮了模型誤差(X,Y)，可重復再現性和參數在X坐標上的準確性以及每百萬次采樣數的缺陷率最小值為1000(99.9%的在技術規范規定以內)。
在最穩定的工作點處允許使用最大的參數變量值且不會超出設計空間的界線，也就是說，參數的調整出錯風險非常小，例如為設計空間的0.1%，不會影響HPLC高效液相色譜分離的質量(Rs,krit≥1.5;tRmax≤20分鐘)。
工作點分析：工作點分析是從最佳工作點或者最穩定工作點出發確定極限值與風險性相互關系的一件工具。利用工作點分析這一工具可以估計各個參數在各自工作點處的最大允許公差、或者說是最大允許偏差。此時，也可以對參數的設置精度進行數學計算。為了把HPLC高效液相色譜分離技術優化可能出現的風險減小到最低，應考慮：這些參數中的不可靠因素各會帶來什么后果，單一模型中的不可靠性會對目標值帶來什么影響。風險評估方法本身就在極限值的范圍內了，按照蒙特卡洛模擬計算出來，并用最大失誤分析百分比的形式表示(超出技術規范的可能性)，或用Plot設計空間中的DPMO輪廓線來表示的(見圖4和圖5)。
各圖所表示的是在乙腈中的甲醇三元提取劑(tC)=0～100%和水質提取劑A的酸堿度PH值2.0～3.2之間基礎上所進行的試驗而繪制的。圖中的綠色區域表示的是失誤率小于0.1%、滿足技術規范要求概率很高(Rs,krit≥1.5;tRmax≤20分鐘)的設計空間。
這一最穩定區域的面積明顯的大于最佳優化區域的面積。
表1.七大因素優化的最佳工作點和最穩定工作點數據
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七大因素優化的工作點 |
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重要因素 |
模擬優化（目標值：Rs和tRmax）
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最佳工作點 |
最穩定工作點 |
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梯度時間tG（分鐘）
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38,3
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31,4 |
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溫度T（攝氏度）
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30,0 |
34,3 |
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三元提取劑成分tC（B2在B1中的容積%）
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4,0 |
14,3 |
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初始濃度%Bs（B的容積%）
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5,7 |
5,7 |
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最終濃度%Be（B的容積%） |
90,1 |
91,4 |
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酸堿度PH值
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2,9 |
3,0 |
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流動系數F（ml/分）
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1,4 |
1,4 |
統計試驗方法
為了能夠在HPLC高效液相色譜分離技術的分離結果達到很高的質量水平統計試驗方法DoE是一個不可或缺的工具。當HPLC高效液相色譜分離中的7個重要參數同時都在變化時，才有可能找到高效液相色譜分離的最穩定工作點、實現多個目標值的同時最佳化。在最穩定工作點的優化中，應有參數在一定范圍內變化而不損失目標值的可能性。最穩定工作點能夠保證HPLC高效液相色譜分離過程的有著很高的最穩定性，失誤率低于0.1%。