此處介紹蔬菜中維生素K1的測定方法(HPLC法)和食物及飼料中水溶性維生素K3(甲萘醌)的測定方法
一、蔬菜中維生素K1的測定方法-HPLC法
1.原理
蔬菜中的維生素K1經有機溶劑提取后，經失活的磷酸鹽處理過的氧化鋁色譜柱進行凈化，再用液相色譜法將維生素K1分離并進行定性定量測定。
2.適用范圍
本標準適用于各類蔬菜、綠色植物及其干制品中維生素K1的測定。
3. 儀器：
(1) 實驗室常用設備
(2) 打碎機
(3) 202-R型恒溫干燥箱
(4) 色譜柱：為0.8cm×30cm的玻璃柱，底端收縮變細，并裝有活塞，活塞上約1 cm處有一玻璃篩板，篩板孔徑為16～30μm，柱上端膨大為容積約30ml的儲液池。使用前需干燥
(5) 旋轉蒸發器
與旋轉蒸發器配套的旋轉蒸發瓶：具塞，圓底，容積為150ml。
(6) 恒溫水浴鍋
(7) 高純氮氣
(8) 高速離心機
與高速離心機配套的小離心管：具塞，容積為1.5～3.0ml。
(9) 紫外分光光度計
(10) HPLC：高效液相色譜儀，帶紫外檢測器
4.試劑
除特殊說明實驗用水為蒸餾水，試劑為分析純，有機溶劑使用前需重新蒸餾。
3.1 無水硫酸鈉：使用前需在150℃的烘箱內烘烤4～8小時，以去除水分。
3.2 0.14mol/L Na2SO4溶液：稱取20g無水硫酸鈉，用蒸餾水溶解后定容至1L。
3.3 丙酮：分析純。
3.4 石油醚：沸程30～60℃，分析純。
3.5 0.6mol/L碘化鉀溶液：稱取10g碘化鉀，用蒸餾水溶解定容至100ml。
3.6 5g/L淀粉液：稱取0.5g可溶性淀粉，用水溶解定容至100ml。
3.7 乙醚：分析純。不含過氧化物。
(1) 過氧化物的檢查方法：用5ml乙醚加1ml0.6mol/L碘化鉀溶液，振搖1min，如有過氧化物則放出游離碘，水層呈黃色。或加4滴5g/L淀粉液，水層呈藍色。則該乙醚含有過氧化物需處理后使用。
(2) 去除過氧化物的方法：重蒸時瓶中加一段純鐵絲，棄去10%初餾液和10%殘留液。
3.8 洗脫液：石油醚+乙醚(97+3)。
3.9 甲醇：優級純。
3.10 正己烷：優級純。
3.11 磷酸氫二鈉：分析純。
3.12 中性氧化鋁：100～200目。
3.13 氧化鋁的處理：
(1) 磷酸鹽處理氧化鋁：取250g中性氧化鋁，20g磷酸氫二鈉，1.6L蒸餾水，放入容積為2L的錐形瓶中沸水浴30min，不時搖動或攪拌。冷卻，倒掉上層液體(包括懸浮的細小顆粒)，然后用布氏漏斗抽濾。將殘留物轉至平底玻璃皿中，于150℃干燥箱中烘烤3～5h至兩次稱量相差3g以下，烘烤過程中不時攪拌，以避免結塊，冷卻后放入干燥器中保存。
(2) 失活處理氧化鋁：使用前，將磷酸鹽處理的氧化鋁，加入具塞錐形瓶中。每100g氧化鋁加9.0ml去離子水，蓋緊瓶塞，蒸汽浴或80℃干燥箱加熱 3～5min，劇烈搖動錐形瓶，使氧化鋁可以自由流動，無結塊。冷卻，靜置30分鐘，使水分分布均勻。
(3) 驗證處理過的氧化鋁：取標準應用液1.0ml，用氮氣吹干，再用石油醚溶解定容至1.0ml。然后按5.3裝柱，將標準溶液加入柱上，按5.4凈化步驟進行柱色譜，用旋轉蒸發瓶收集洗脫流出液，濃縮，氮氣吹干，用正己烷定容至1.0ml，HPLC測定，記錄峰面積或峰高(A)。另取標準應用液直接測定，記錄峰面積或峰高(Ar)。將A與Ar進行比較，其值在0.97～1.03之間(A/Ar)，則說明柱效較好，氧化鋁處理合格。否則需重新進行失活處理。如果再次驗證比值仍不能達到0.97，則需重新制備氧化鋁。
3.14 維生素K1標準：Sigma公司，純度>98%。
3.15 標準貯備液：精確稱取50.0mg維生素K1標準，用正己烷溶解定容至50.0ml，即1.0mg/ml。將儲備液分裝成安瓿，冷凍保存。
3.16 標準工作液：取標準貯備液， 用正己烷準確稀釋50倍, 即20.0μg/ml。
標準工作液的標定：取標準應用液測定紫外吸光值，波長248nm，比色杯厚度1cm，以正己烷為空白，測定3次，取平均值，按下式計算標準應用液濃度。
X1 = | A | ×M ×103 | ……………………………………(1) |
式中： X1 -- 維生素K1標準應用液濃度，μg/ml;
A -- 標準應用液平均紫外吸光值;
E -- 摩爾消光系數，20,000;
M -- 維生素K1分子量450.7;
103 -- 換算成μg/ml的換算系數。