利用雙光子活體成像的方式對角膜干細胞進行觀察記錄

　　復層扁平上皮又被稱為復層鱗狀上皮（Stratified squamous epithelia），通常存在于皮膚、食道以及口腔等部位的表面，會經歷不斷的再生過程，在此過程中終末分化的細胞從表面脫落并由具有干性的細胞進行補充。由于細胞不斷丟失，復層扁平上皮必須處于一種動態平衡狀態，以維持其組織結構和功能的正常運行。其中，角膜是一種獨特的復層扁平上皮，具有典型的組織學特征和屏障功能，但是其干細胞組織的方式與食道等區域并不相同。角膜位于眼球的表面，對視力至關重要，它是眼睛的保護屏障并且可以將光線折射到視網膜上。角膜上皮中的干細胞具有一定分層結構，并駐留在一個叫做角膜緣（Limbus）的特殊組織中。但是一直以來，角膜緣處單個干細胞的行為是什么樣的還未被直接可視化地觀測過，因此角膜緣中細胞組成的異質性以及功能的多樣性還未可知。

　　近日，來自美國賓夕法尼亞大學Panteleimon Rompolas研究組在Cell Stem Cell雜志上發表題為Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche的文章，利用雙光子活體成像的方式對角膜干細胞以及其子代細胞的活性進行了系統性、長時期的觀察和記錄。

　　為了對小鼠的角膜進行觀察，作者們建立了一種可以直接對小鼠眼睛進行長期觀測的、基于雙光子顯微鏡的活體成像技術（圖1）。關于小鼠以及人類中角膜緣內干細胞的標記物有一定的區分，但是目前為止還沒有特異性確認可以只標記這些干細胞的標記物5。因此，作者們提出一種方案，可以通過無偏地標記單個細胞，并通過活體成像直接追蹤其各自的譜系，隨后回顧性地確定角膜緣內所有潛在的干細胞群。為此，作者們利用p63CreERT2在復層扁平上皮活性對其中的細胞進行標記，通過聯用雙熒光的報告子最終可以標記角膜、角膜緣以及結膜組成的整個表面上皮中的干細胞和祖細胞。在對完整的眼球進行成像后，使用相同的參數可以對小鼠的眼睛再次進行成像，可以在誘導之后對其中的細胞進行長時程觀察。作者們發現在角膜緣的細胞克隆與膠原纖維束以及血管共同定位，其中還包括一些角膜的神經以及免疫細胞。另外，根據細胞分布的位置、行為等，作者們發現角膜緣中至少存在兩種特異的細胞群，隨后作者們根據這兩種細胞群距離角膜的位置將其分別稱為內角膜緣細胞（Inner limbus）以及外角膜緣細胞（Outter limbus）。

　　圖1 基于雙光子的角膜緣活體成像實驗方案

　　通過活體成像記錄實驗，作者們發現外角膜緣細胞群體中存在一群緩慢分裂細胞。在追蹤后只在持續分裂的細胞中能夠保熒光信號。通過對成像的數據進行分析，作者們發現熒光信號保留的細胞行為存在異質性。比如保留熒光標記的細胞進行分裂后，子細胞始終保持在相同的位置，沒有發生終末分化。也有部分被標記的細胞會在整個成像期間保持靜息狀態。進一步地，作者們想知道這些分裂緩慢的熒光標記細胞是否是維持角膜穩態的祖細胞來源。為了回答該問題，作者們引入了一個在角蛋白啟動子控制下的光激活GFP轉基因小鼠品系，在光激活可以在細胞核中產生顯著的信號，該信號會隨著細胞的分裂被逐漸稀釋。通過該實驗，作者們發現這些分裂緩慢的熒光標記細胞正是維持角膜穩態的來源。

　　為了進一步評估角膜緣干細胞的功能，作者們利用飛秒脈沖激光在原位進行特異性干細胞消融，同時保持周圍細胞龕的完整性，防止造成對于周圍組織的損傷。在對內角膜緣細胞進行消融后，可以觀察到角膜細胞克隆在干細胞移除后不能持續生長，并且出現向角膜中心的退化。那外角膜緣細胞在損傷后的反應是什么呢？為此，作者們在角膜中央劃傷，并追蹤位于角膜外緣的細胞的反應。作者們發現有證據表明，在傷口愈合過程中，來自外角膜緣的細胞離開原本的位置并擴展到角膜區域，放射狀的譜系會在角膜受傷后出現持續數周。該結果發現，角膜緣區域中的內角膜緣細胞和外角膜緣細胞在角膜穩態維持以及傷口愈合方面具有不同的功能。

　　圖2 工作模型

　　總的來說，該工作通過雙光子顯微鏡為基礎的長時程活體成像實驗，揭開了小鼠復層扁平上皮組織角膜中存在穩態維持以及譜系再生這兩種功能的譜系。內角膜緣干細胞主要進行對稱分裂，維持祖細胞的數量以支持角膜穩態；外角膜緣干細胞促進角膜損傷后的再生。該研究為不同的干細胞群體的功能多樣性提供了新的見解。