利用蛋白質定向趨異進化策略在羥基酪醇生物合成

　　在自然界中，具有混雜催化功能的蛋白質在自然選擇的壓力下能夠趨異進化為活性更高或功能更專一的不同蛋白質。將趨異進化概念應用到蛋白質的定向進化工程改造中，能夠將天然蛋白改造成為底物專一性各不相同的多種蛋白。定向趨異進化即是在定向進化和趨異進化理論上建立的一種重新設計酶的催化功能的蛋白質工程學方法。

　　羥基酪醇（Hydroxytyrosol），主要存在于橄欖屬植物的果實和枝葉中，是一種天然的強抗氧化劑，具有很強的清除自由基能力，可預防自由基引起的直接損傷以及紫外線誘導的氧化應激等。此外研究報道羥基酪醇還具有很好的抗腫瘤活性及降血脂、抗動脈硬化、治療糖尿病和肥胖癥、抗菌消炎等功效。已報道的以酪氨酸為底物生產羥基酪醇的生物合成途徑由于需要酪氨酸羥化酶及四氫生物蝶呤循環系統，造成羥基酪醇的生物合成效率低下，羥基酪醇產量很低（29 mg/L），而底物轉化率不足20%。中國科學院微生物研究所唐雙焱課題組在文獻調研的基礎上，用同一套途徑酶設計了兩條不同的以酪氨酸為底物生產羥基酪醇的生物合成途徑。研究發現當兩條途徑同時工作時，羥基酪醇的生物合成效率大大提高。因此在前期工作基礎上，唐雙焱團隊利用蛋白質定向趨異進化策略對大腸桿菌單加氧酶HpaBC進行了改造，獲得了分別具有酪醇羥化酶、酪胺羥化酶及酪醇/酪胺羥化酶混雜催化活性的三個優良突變體A10、D11和H7，這些突變體能夠有效催化羥基酪醇新生物合成途徑中天然缺失的步驟。研究表明具有酪醇/酪胺羥化酶混雜催化活性的HpaBC突變體H7能夠有效減少蛋白質過表達造成的細胞代謝負擔，并能實現生物合成碳流在兩條途徑之間的高效分配，從而通過對多條合成途徑間代謝流的重排顯著提高羥基酪醇生物合成效率。在沒有進行發酵條件優化的情況下，羥基酪醇產量達到1890 mg/L，轉化率可達到82%。代謝工程通常聚焦于單條合成途徑中酶的調控，唐雙焱團隊的該項工作展示了基于酶的混雜催化活性設計多條合成途徑，通過減少細胞代謝負擔并實現碳流的重排，實現羥基酪醇的高效生物合成，進一步拓展了蛋白質定向進化手段在代謝工程研究中的應用，為天然產物生物合成途徑的設計構建提供了新的思路和技術依據。