加入接頭實驗

10 mol L ATP PNK (9.3 U ul) 5 x T4 DNA 連接酶緩沖液 LoTE

1.稀釋引物IB和2B, 至質量濃度為350ng/V。

2.加入下列試劑進行引物5’末端磷酸化：

3.在37℃ 下孵育30 min。

4.在65℃ 下放置 10 min熱失活PNKo

5.將36ul 的引物IA加入到80ul磷酸化的引物1B中，同樣加36ul引物2A到磷酸化的2B(終濃度為217ng/ul)。

6.使引物退火：先加熱到95℃，保持 2 min, 隨之在65℃ 下放置lOmin，在37℃ 下放置 10 min, 再在室溫下放置20 min。

注意：可先取200ng接頭進行試連接，然后進行12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳。如果磷酸化是成功的，大多數接頭（>70%) 應連接成為二聚體（±80bp)。

實驗方案 A

1.將接頭 1 連接到一份結合于 Dynabeads 上的已被 NlaIII 酶解的 cDNA，接頭 2 則連接于另一份。在冰上操作加入下述物質：

2.加熱到 50C, 保持2 min, 然后在室溫下放置15 min，使接頭與 MaIII 酶解的 cDNA 退火。

3.加入 2ul T4 DNA 連接酶（5U/ul), 然后在 16°C 連接接頭 2 h。

4.在接頭連接完成后，用 2004 的 IX 結合及沖洗緩沖液沖洗磁珠 4 次，再用 200ul 的 1X 限制性緩沖液沖洗 2 次。

5.完成最后一步沖洗后，固定磁珠并移去 LoTE。