動物組織塊DNA的提取

實驗概要

學習并掌握動物組織總DNA的提取方法及其原理。從肝臟組織中提取到一定量的純凈的DNA樣品。

實驗原理

DNA是一切生物細胞的重要組成成分，主要存在于細胞核中。通過研磨和SDS作用破碎細胞；苯酚和氯仿可使蛋白質變性，用其混合液（酚：氯仿：異戊醇）重復抽提，使蛋白質變性，然后離心除去變性蛋白質；RNase降解RNA，從而得到純凈的DNA分子。

主要試劑

1．生理鹽水
2．十二烷基硫酸鈉（SDS）
3．三羥甲基氨基甲烷（Tris）
4．乙二胺四乙酸（EDTA）
5．飽和酚
6．氯仿
7．異戊醇
8．無水乙醇
9．75%乙醇
10．蛋白酶K
11．RNase酶（

試劑配制
1．Tris–HCL 1mol/L PH8.0 50ml
配制方法：
40ml雙蒸水，6.057g固體Tris放入燒杯中溶解，用濃鹽酸調PH值到8.0，轉移到50ml容量瓶中，加入雙蒸水定容，搖勻后，轉到準備好的輸液瓶中，貼上標簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存備用。
2．生理鹽水: 0.85%NaCL 100ml
配制方法：
在20ml雙蒸水中溶解0.85g固體NaCL，加水定容至100ml，搖勻后，轉到準備好的輸液瓶中，貼上標簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存備用。
3．EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml
配制方法：
將9.08g的EDTA·Na₂·2H₂O溶解于40ml雙蒸水，用1g的NaOH顆粒（慢慢逐步加入）調PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA難溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA·Na₂·2H₂O。
4．TES緩沖液（釋放DNA） 100ml
配制方法：
將0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml雙蒸水，在分別加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml的Tris-HCl (pH=8.0)，加定容至100ml, 搖勻后，轉到準備好的輸液瓶中，貼上標簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存備用。
5．10% SDS（變性劑破細胞壁）100ml
配制方法：
將10g的十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解于80ml雙蒸水于68℃加熱溶解，用濃HCl調至PH=7.2，定容至100ml，搖勻后，轉到準備好的輸液瓶中，貼上標簽，4℃保存備用。
6．蛋白酶K（降解蛋白質）：20mg/mL 無菌三蒸水溶解。
7．RNA酶（降解RNA）
配制方法：
將胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的Tris·CL（PH7.5）、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份存于–20℃。
8．氯仿：異戊醇=24：1 100ml
按24:1的比例加入氯仿、異戊醇，搖勻，轉到準備好的瓶中，貼上標簽，4℃保存備用。
9．TE緩沖液（溶解DNA） PH8.0 50ml
配制方法：
將0.5ml 的10mmol Tris-HCl(PH8.0) 、0.1ml的0.5mol/l EDTA(PH8.0) 加入到50ml的容量瓶中，調PH8.0定容至50ml搖勻后，轉到準備好的瓶中，貼上標簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存備用。

主要設備

1．高速離心機
2．烘箱
3．冰箱
4．水浴鍋
5．微量移液器
6．高壓滅菌鍋

7．手術剪刀、鑷子、吸水紙
8．微量取液器
9．研缽、1.5mL 離心管、一次性手套、1.5mL離心管架、記號筆等

實驗材料

動物組織塊

實驗步驟

1．組織塊解凍，用生理鹽水洗去血污，剪取約0.5g組織，放入1.5ml離心管中，剪碎。
2．加入0.45ml TES混勻，再加入50ul SDS（10%），5.0ul蛋白酶K（20mg/ml），充分混勻后，于56°C保溫4-6h，每2h搖1次。
3．放置到室溫，加入等體積飽和酚（500ul），顛倒混勻，10000r/m，離心10m，分離水相和有機相，小心吸取上層含核酸的水相，到一個新的1.5ml離心管。
4．加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），顛倒混勻，10000r/m，離心10分鐘，取上層轉移到新的1.5ml離心管中。
5．加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），顛倒混勻，10000r/m，離心10分鐘，取上層清液到一個新的1.5ml離心管。
6．加入2.5倍體積的-20°C預冷的無水乙醇沉淀DNA，觀察現象。
7．12000 r/m，離心10分鐘，棄乙醇。
8．-20°C保存的75%乙醇洗滌，10000 r/m，離心5分鐘，去乙醇，55°C干燥DNA。
9．加入適量TE溶解DNA（具體依DNA的多少而定），-20°C保存備用。

注意事項

1．抽提每一步用力要柔和，防止機械剪切力對DNA的損傷。
2．取上層清液時，注意不要吸起中間的蛋白質層。
3．乙醇漂洗去乙醇時，不要蕩起DNA。
4．離心后，不要晃動離心管，拿管要穩，斜面朝外。