動物肝臟DNA的提取

一、目的：

了解分離提取DNA的一般原理，掌握從動物肝臟中提取DNA的方法。

二、原理：

在濃氯化鈉（1—2mol·L-1）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小。在稀氯化鈉（0.14mol·L-1 ）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液，將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽提出來。

將抽提得到的核蛋白用SDS（十二烷基磺酸鈉）處理，DNA（或RNA）即與蛋白質分開，可用氯仿一異戊醇將蛋白質沉淀除去，而DNA則溶解于溶液中。向溶液中加入適量乙醇，DNA即析出。

為了防止DNA（或RNA）酶解，提取時加EDTA（ethy-lenediamine tetracetic acid，乙二胺四乙酸）。

三、器材及試劑：

1．器材：

①新鮮豬肝（一次用不完一定要冷凍保存）

②勻漿器

③離心機5000r·min-1

④量筒50ml（×1）、10ml（×1）

⑤水浴鍋

⑥紗布

⑦真空干燥器

2．試劑：

①5mol·L-1 NaCl溶液：將292.3gNaCl溶于水，稀釋至1000ml。

②0.14mol·L-1 NaCl-0.10mol·L-1 EDTA-Na溶液：溶8.18gNaCl及37.2gEDTA-Na于蒸餾水，稀釋至1000ml。

四、操作步驟：

1．取豬肝20~30g，用適量0.14mol·L-1NaCl-0.10mol·L-1 EDTA溶液洗去血液，剪碎，加入約30~50ml0.14mol·L-1 NaCl-0.10mol·L-1 EDTA溶液，置勻漿器或研缽中研磨，研磨一定要充分，待研成糊狀后，用單層紗布濾去殘渣，將濾液離心10分鐘（4000r·min-1）棄去上清液，沉淀用0.14mol·L-1NaCl-0.10mol·L-1 EDTA溶液洗二、三次。所得沉淀為脫氧核糖核蛋白粗制品。

2．向上述沉淀物加入0.14mol·L-1 NaCl-0.10mol·L-1EDTA溶液，使總體積為37ml，然后滴加25%SDS溶液3ml，邊加邊攪拌。加畢，置60℃水浴保溫10分鐘（不停攪拌）溶液變得粘稠并略透明，取出冷至室溫。此步操作系使核酸與蛋白質分離。

3．加入5mol·L-1 NaCl溶液10ml，使NaCl最終濃度達到1mol·L-1 ，攪拌10分鐘，加入約一倍體積的氯仿-異戊（丙）醇混合液，振搖10分鐘，靜置分層，取上、中兩層液離心10分鐘（4000r·min-1）。去掉沉淀，上層清液徐徐加入1.5—2倍95%乙醇，DNA沉淀即析出，用玻璃棒順著一個方向慢慢攪動，則DNA絲狀物即纏在玻棒上。

4．將DNA粗品置于27ml0.015mol·L-1 NaCl-0.0015mol·L-1檸檬酸三鈉溶液中，再加入3ml1.5mol·L-1 NaCl-0.15mol·L-1 檸檬酸三鈉溶液，攪勻，加入一倍體積氯仿—異戊（丙）醇混合液，振搖10分鐘，離心（4000r·min-1 ，10分鐘），傾出上層液（沉淀棄去），加入1.5倍體積95%乙醇，DNA即沉淀析出。離心，棄去上清液，沉淀（粗DNA）按本操作步驟重復一次。

5．將上步所得沉淀溶于27ml0.015mol·L-1 NaCl-0.0015mol·L-1 檸檬酸三鈉溶液中，然后以線狀徐徐加入2倍95%乙醇，邊加邊攪，取出絲狀DNA，依次用70%、80%、95%及無水乙醇各洗一次，真空干燥。保存待用。

五、結果與討論：

1．所提取的DNA是否是純品？如何進一步提高其純度？

2．DNA提取過程中的關鍵步驟及注意事項有哪些？