化學感受態細胞基礎操作方法

　化學感受態細胞該菌株衍生自大腸桿菌菌株B，具有lon和ompT蛋白酶缺陷的優點，是目前應用廣泛的表達宿主菌之一，其操作方法如下：

　　1、化學感受態細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，6分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質粒或連接產物）并用手滑動EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

　　2、42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置5分鐘，晃動會降低轉化效率。

　　3、向離心管中加入0.9mL室溫S.O.C.(S.O.C.營養豐富，可提高轉化效率)或LB培養基。

　　4、30℃，250rpm復蘇60分鐘。當質粒中含有不穩定片段時，30℃培養可降低錯誤重組的概率，若轉化controlpUC19計算轉化效率，則需37℃，225rpm復蘇60分鐘

　　5、篩選平板提前拿出放30℃孵育使平板溫度保持30℃，吸取50-100μl直接涂篩選平板或5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的LB培養基上。

　　6、將平板倒置放于30℃培養20-24小時或37℃過夜培養。當質粒中含有不穩定片段時，30℃培養可降低錯誤重組的概率，若轉化controlpUC19計算轉化效率，則需37℃培養過夜。

　　化學感受態細胞注意事項:

　　1、對不穩定DNA的片段克隆或逆轉錄病毒/慢病毒載體的構建，涂板后平板應在30℃培養，以減少發生錯誤重組的概率。

　　2、制備高純度病毒質粒時，應使用新鮮轉化的平板接菌，新鮮菌液提取質粒，菌液不可低溫保存后使用。

　　3、對不穩定的克隆或病毒質粒優先以質粒狀態保存，盡量避免將質粒保存在大腸桿菌細胞中。

　　4、化學感受態細胞一般在冰中緩慢融化。插入冰中10分鐘內加入目標DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉化效率。混入目的DNA時應輕柔操作。

　　5、轉化高濃度的質粒或高效率的連接產物可相應減少終用于涂板的菌量。