區域特異性誘變實驗

DNA

乙酸鈉 亞硝酸鈉 TE 無水乙醇 dNTP 反轉錄酶 RNA酶 洗脫液 溴化乙錠

水浴鍋 培養箱

1.  用限制性內切核酸酶消化DNA以獲得目的DNA片段，將靶片段雙向克隆到M13噬菌體載體或含有M13復制起始子的質粒載體中。從100 ml 感染細抱培養物中提取單鏈DNA。

2.  在三個微量離心管內各加入40 ug 1 mg/ml 的單鏈DNA，如果靶序列的兩條鏈都要被利用，則需用6個反應。

3.  亞硝酸反應：在一個管內加入10 ul pH4.3的2.5 mol/l 乙酸鈉和50 ul 2 mol/l 亞硝酸鈉，混勻，室溫溫育60 min。

4.  甲酸反應：在另一管內加60 ul 濃甲酸，混勻，室溫溫育10 min。

5.  肼反應：在第三個管內加60 ul 濃肼，混勻，室溫溫育10 min。

6.  毎管加100 ul 2.5 mol/l pH5.5的乙酸鈉，30 ug 擔體tRNA和1 ml 無水乙醇，置干冰中凍至-80℃，放置10 min，離心10 min，去上清，重復乙醇沉淀兩次，再用80 ul TE緩沖液重懸DNA。

7.  在重懸的DNA內加10 ul 4種dNTP混合液，10 ul 10x反轉錄酶緩沖液和100 pmol 的寡核苷酸引物。先在85 ℃溫育5 min，再于40℃溫育15 min。

8.  加10 ul 4種dNTP混合液和30~40 U 的AMV反轉錄酶，37℃溫育1 h。

9.  用緩沖液平衡酚抽提和乙醇沉淀DNA，DNA重懸于100 ul  10x限制性內切酶緩沖液，并用適當的限制性內切酶切割，以便從載體中回收片段。

10.  酚抽提和乙醇沉淀DNA。DNA重懸于10~15 ul 洗脫緩沖液，并加0.5 ul 2 mg/ml RNA酶A，37℃溫育15 min 以降解擔體tRNA。

11.  在非變性的6%聚丙烯酰胺凝膠電泳上，分離從載體上切下的目的片段，凝膠用溴化乙錠染色，切膠，洗脫出DNA。

12.  將純化的插入DNA連接到具有互補末端的質粒或細菌噬菌體載體中。通過常規的轉化程序將連接混合物導入合適的細菌中。

由于不同的化學誘變劑性能差別很大，在使用前必須對影響其效果的溫度、PH值、光照、溶劑等做清楚的分析，同時對其半衰期、毒性及防護也要充分了解，這樣才能保證使用的有效性和人體安全性。

1. 由于不同的化學誘變劑性能差別很大，在使用前必須對影響其效果的溫度、PH值、光照、溶劑等做清楚的分析，同時對其半衰期、毒性及防護也要充分了解，這樣才能保證使用的有效性和人體安全性。

2. 當篩選方法可信度高時，往往檢測方法是比較繁瑣的（尤其是涉及一些蛋白質或氨基酸含量變化的突變類型）這時為了提高篩選工作量往往降低篩選的可信度，減少篩選的繁瑣程度，而在復篩中進一步加以確定。