單克隆抗體的制備（一）

材料

1. 免疫原

一旦作出制備單克隆抗體的決定后，首先要考慮的問題是使用何種免疫原(第2章）。免疫原(或抗原）可以有多種：全細胞、細胞提取物、純化蛋白、融合蛋白、多肽、糖 類 、脂類或 D N A 等 。此外，制備單克隆抗體時不需要很純或單一特異性的抗原，因為在單克隆抗體篩選的過程時，每個克隆的特異性都會得到體現。全細胞或細胞裂解物（每 次 注 射 I07個細胞）可以作為細胞內或細胞外抗原分子的天然形式; 但特定抗原含量的多少會影響免疫的效果。過度表達特定蛋白質的細胞系通常是很好的抗原來源。純化的重組蛋白或融合蛋白也是常用的免疫原(每次注射10?IOOug), 可以產生針對很多不同抗原表位的抗體 。如果免疫原是以融合蛋白存在，重要的是還要制備免疫原本身或免疫原與其他蛋白質的融合蛋白，以便在篩選特異性抗體時，得到針對免疫原的單克隆抗體而不是針對融合蛋白另一部分的單克隆抗體。類似的，多肽抗原(大于1 0 個氨基酸)必須與載體蛋白偶聯

才能用于免疫。由于這些載體蛋白具有很高的免疫原性，所以多肽應該與不止一種載體蛋白偶聯，以便篩選出的單克隆抗體只識別多肽而不識別載體蛋白，如鑰孔戚血藍素(KLH) 和牛血清白蛋白。抗多肽的抗體能鑒別小的線性序列，并且已經被證明能有效地區別靶標是否被修飾，如區分特定肽上的磷酸化或去磷酸化。

近年來，用質粒為基礎的技術在體內誘導表達有免疫原性蛋白的新方法已經產生。基因免疫接種在采用下列免疫途徑時是相當有效的：脾內注射、肌肉注射[2]、皮內注射（用基因槍[3, 4]等儀器設備進行操作）或靜脈注射[5? 7]等 。這些方法的不同在于將質粒DNA導入宿主細胞的機制不同。然而，每種方法都依賴于哺乳動物表達載體上的獨特編碼序列 ，這些外源D N A 序列隨后被宿主細胞攝取，在體內產生蛋白質。更有用的是，當抗原難以制備或基因產物不清楚時，基因免疫接種可以被運用。質粒為基礎的免疫可在體內產生足量的目標蛋白，從而誘導機體產生強有力的體液免疫應答。這種技術還可用在轉基因小鼠，產生針對靶抗原的特異性抗體[5』 5a]。

糖類決定基往往表達在病原微生物表面，可以引起適度的體液免疫，但很少引起再次免疫應答。因此，糖類決定基通常只能誘導產生1 g M 的抗體應答，如針對血型抗原的應答 。將糖類抗原偶聯在載體蛋白質上后也能增強機體對它的應答。游離的脂質或者脂蛋白 經 C D l分子的抗原提呈后可以誘導產生與這些半抗原樣片段反應的抗體。核酸很難誘導體液免疫的產生。

總的來說，抗體分子識別的蛋白質抗原決定基分為三種類型：構象表位、線性表位以及新表位。構象表位是由序列上不相連續的多肽(非線性序列）形成的具有三維結構的表位 。構象表位表示抗原是以天然形式存在的，當蛋白質分子變性時，構象表位會被破壞。線性表位（由相鄰氨基酸殘基組成的序列）不會因蛋白質變性而破壞，但是當蛋白質處于天然折疊狀態時，線性表位可能暴露也可能隱藏在分子內部。抗體結合的線性多肽就是

線性表位的一個例子。新表位是指天然蛋白質水解后新表達的表位。識別新表位的抗體通常不能識別天然蛋白質。

顯然，免疫原的形式會影響宿主體液免疫產生的抗體譜。用全細胞、細胞裂解物或者用在體內產生的蛋白質免疫接種會導致產生大量的抗體，這些抗體可用來鑒別表達在天然蛋白質上的抗原表位(構象表位、線性表位和新表位）。這些抗體可能用于廣泛生物學功能的研究，包括流式細胞術或功能性中和作用。多肽免疫接種通常只是單一抗原表位的暴露。識別這些線性表位的抗體并不總能結合天然球狀蛋白；然而，這些線性表位即便在天然蛋白質變性的情況下通常也是能保存的。這種抗多肽的抗體通常在免疫印跡(Western blot)或免疫組化中工作得很好。因此，選擇免疫原制備抗體時應該考慮到所

制備抗體的最終用途, 并應該根據其用途決定用何種方法篩選抗體更合適。雖然不能保證某一種形式的免疫原將會產生有特定功能活性的抗體，但是具有幫助我們篩選到具備獨特特異性的抗體的可能性。所需用于免疫接種和抗體初步篩選的蛋白質抗原量大約是 2 mg。

在免疫接種前，檢查抗原中是否含有潛在病原體是必要的。這適用于用細胞系、細胞系產生的蛋白質，或者在有血清存在的情況下制備的蛋白質。篩選試驗，稱為小鼠抗體生產篩查試驗（mouse antibody production screening ,MAPS) ，包括用每種特定抗原（2 XIO7 個細胞或10?IOOug蛋白質）接種經檢疫的無特定病原體（SPF)動 物 ，觀 察 4 周 。 4周 后 ，收集免疫后動物的血清，和免疫前的血清比較對一系列已知病原體的反應。陽性結果意味著抗原已被污染，應當拋棄；陰性結果表明抗原是安全的，可用于體內注射。

2 免疫用的動物

小鼠、大鼠、亞美尼亞倉鼠和兔中分離的淋巴細胞的雜交瘤技術已經很成熟。小鼠是極好的免疫接種對象，原因是：多個純系株易得到且價錢合理; 小鼠易操作; 有很多試劑可用以檢測鼠源免疫球蛋白；小鼠對外來蛋白質能產生良好的免疫應答。另外，小鼠淋巴細胞能夠和多種鼠源骨髓瘤細胞系發生有效融合（表 5. 1)。此 外 ，在免疫系統功能得以保留的情況下，基因打靶(gene-targeted)小鼠能夠產生針對特定靶蛋白的抗體。大鼠同樣是一個好的宿主，尤其是在制備針對小鼠蛋白的抗體時。小鼠和大鼠的骨髓瘤細胞都可以與大鼠的 B 細胞融合。亞美尼亞倉鼠是獨特的模型，因為從系統發生學上它們的親緣關系和小鼠相差甚遠，所以能夠對小鼠、大鼠或人類來源的蛋白質產生良好的免疫應答，而且能夠和小鼠骨髓瘤細胞系發生有效的融合[8』 9,9a ]。更重要的是，亞美尼亞倉鼠產生的抗體在小鼠體內是無免疫原性的，使它們成為一些疾病的理想的體內模型[9——u ， lla]。這種模型已經廣泛用于制備高親和力的針對小鼠細胞因子、受體和轉錄因子等的抗體。常 用 的 骨 髓 瘤 細 胞 系

兔的雜交瘤細胞是由免疫兔的脾細胞和兔的骨髓瘤細胞系融合得到的[17]。因此，根據免疫原的來源和抗體的最終用途，一系列的動物模型可供選擇用于制備具有所需特異性和功能的獨特的單克隆抗體試劑。

一種替代細胞融合制備單克隆抗體的方法是使用淋巴細胞條件轉化鼠Cimmortom 〇use)[18]。這些轉基因小鼠攜帶SV4 0 T 抗原的溫度敏感突變體，該 基 因 由 H-2Kb 啟動子控制。免疫上述轉基因動物后，脾細胞在允許的33°C 的培養條件下能夠表達熱不穩定的 SV40 T 抗 原 ，導 致 B 細胞的轉化，從而不需要與永生細胞系融合，而且還避免了由于異核體細胞（雜交瘤細胞）的產生而出現的不穩定現象。從 這 些 不 斷 生 長 的 B 細胞中能篩選到分泌特異性抗體的細胞株。

在完善的雜交瘤技術的基礎上努力開發更加有效的完全人源化抗體，促使了 Abgenix公 司 XenoMouse的發展[19』 2°]。這 些 轉 基 因 小 鼠 完 全 缺 乏 小 鼠 和 「 基因，致使它們缺之所有類型的小鼠免疫球蛋白。這 些 缺 乏 和 Ck 基因的小鼠（Ig基因一/一小鼠）也可通過轉基因的方式導入人類IgH及 IgK鏈基因。因此，轉 基 因小鼠XenoMouse具有類似于成年人那樣的能夠產生多樣性初始免疫應答能力的遺傳成分，在接受抗原刺激后能夠產生強有力的再次應答。常規免疫這些轉基因小鼠，將免疫小鼠脾細胞與小鼠源骨髓瘤細胞融合, 是制備一系列高親和力的能夠和任何數量蛋白質反應的完全人源化抗體的新策略。這些抗體具有中和活性，很多已被批準用于人類疾病的治療。