單鏈和雙鏈M13噬菌體DNA的大規模制備

大腸桿菌 F' 菌株 M13 噬菌體原液

乙醇 NaCl 酚 氯仿 聚乙二醇 乙酸鈉 STE TE Tris-HCl

瓊脂糖凝膠 LB 或 YT 培養基 Sorvall GSA 轉頭或相同的轉頭 Sorvall SS-34 轉頭或相同的轉頭 Corex 離心管 硅橡皮圈 無菌試管

一、材料

1. 緩沖液和溶液

乙醇

NaCl （固體）

酚

酚：氯仿（1：1，V/V)

聚乙二醇（20%，m/V，PEG 8000)  溶于水。

乙酸鈉（3 mol/L，pH 5.2）

STE

TE ( pH 8.0)

Tris-HCl ( 10 mmol/L, pH 8.0)

2. 凝膠

瓊脂糖凝膠（1.2%) 懸于 0.5 X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙錠

3. 培養基

5 mmol/L MgCl₂ 的 LB 或 YT 培養基

4. 離心機和轉頭

Sorvall GSA 轉頭或相同的轉頭

Sorvall SS-34 轉頭或相同的轉頭

5. 專用設備

Corex 離心管（30 ml)

硅橡皮圈

無菌試管（13 mm x 100 mm 或 17 mm x 100 mm)

6. 載體和菌株

大腸桿菌 F' 菌株（從用適當宿主菌新劃線分離的 M9 基本瓊脂平板上挑去一個單菌落，接種至一個含 5 ml LB 的 20 ml 的無菌培養試管。溫和振蕩 37℃ 培養 24~36 h，不要使菌生長至穩定期，否則會增加 F' 質粒編碼的菌毛丟失的危險。M13 噬菌體的單鏈 DNA 如果是用于作為寡核苷酸介導的突變，則其應在含 dut 和 ung 基因突變的大腸桿菌中增殖。）

M13 噬菌體原液

二、方法

M13 噬菌體 RF DNA 制備

1. 將 2.5 ml 鋪板菌液轉移至無菌試管（13 X 100 mm 或 17 X 100 mm）。加 0.5 ml M13 噬菌體原液（約 5 X 10¹¹ pfu)，輕拍試管壁混合，室溫放置 5 min。

2. 將感染細胞用裝在 2 L 搖瓶中的 250 ml 預熱至 37℃  的含 5 mmol/L MgCl₂ 的 LB 或 YT 培養基稀釋。37℃ 持續振蕩培養 5 h。

3. 4℃ 4000 g ( Sorvall GSA 轉頭為 5000 r/min) 離心 15 min 收集感染細胞。回收上清可用于按以下步驟 7~17 的方法大規模制備 M13 噬菌體的單鏈 DNA。

4. 細菌沉淀用 100 ml 冰冷的 STE 重懸，4℃  4000 g (Sorvall GSA 轉頭為 5000 r/min) 離心 15 min 回收洗后的細胞。

5. 用堿裂解的方法分離噬菌體閉合環狀 RF DNA。適當增大裂解液的體積。純化 DNA 可用 PEG 沉淀或層析柱純化或 CsCI 梯度離心。

6. 用分光光度法測定 DNA 濃度，并用凝膠電泳法確定其完整性。將閉合環狀 DNA 分成小份 -20℃ 凍存。

250 ml 感染細胞的 RF DNA 的產量為約 200 μg。

M13 噬菌體單鏈 DNA 制備

7. 從感染細胞培養液中的噬菌體顆粒中分離單鏈 DNA, 將步驟 3 的上清轉移至一加有磁攪拌子的 500 ml 燒杯。

8. 上清中加入 10 g PEG 和 7.5 g NaCl, 室溫攪拌 30~60 min。

9. 4℃ 10000 g ( Sorvall GSA 轉頭為 7800 r/min) 離心 20 min 收集沉淀，倒置離心瓶 2~3 min, 使上清流凈，用 Kimwipes 紙巾吸去瓶壁和頸上殘留的上清。

10. 瓶中加入 10 ml 10 mmol/L 的 Tris-HCl ( pH 8.0)，攪動瓶中溶液，并用巴斯德吸管充分沖洗瓶壁，當噬菌體沉淀溶解后，將溶液移至 30 ml Corex 離心管中。

11. 在噬菌體懸液中加入等體積的酚，用硅橡膠塞塞緊后劇烈振蕩 2 min, 混勻內容物。

12. 室溫以 3000 g ( Sorvallss-34 轉頭用 5000 r/min) 離心 5 min, 上層水相轉移至一個新管，再用 10 ml 酚: 氯仿抽提。

13. 將等量的水相轉移至兩個 30 ml Corex 離心管中，各加入 3 mol/L 乙酸鈉（pH 5.2 ) 0.5 ml 和乙醇 11 ml。充分混合后室溫放置 15 min。

14. 4℃  12000 g（Sorvall SS-34 轉頭為 10000 r/min）離心 20 min 回收單鏈 DNA 沉淀， 小心移去上清。

15. 每個管中加入 30 ml 4℃ 70% 乙醇，4℃ 12000 g ( Sorvall SS-34 轉頭為 10000 r/ min) 離心 10 min, 小心盡可能移去上清，倒置離心管使沉淀中的殘液流盡，用 Kimwipes 紙巾吸干管頸處。

16. 室溫放置，使殘余乙醇蒸發，用 1 ml TE ( pH 8.0) 溶解沉淀，-20℃ 貯存。

17. 用分光光度法測定 DNA 濃度，并用瓊脂糖電泳法確定其完整性，將閉合環狀 DNA 分成小份（10~50 μg) -20℃ 貯存。