材料靶抗原：表達于細胞的抗原，或蛋白質、多肽 生理鹽水 無血清培養基：僅用于細胞接種 弗 氏 完 全 佐 劑（ complete Freunds adjuvant， CFA)， Sigma 公司 實驗動物：無 病 原 體 大 鼠 、小 鼠（推 薦 使 用 BALB/c小 鼠）或 倉 鼠（推薦使用Cytogen研究所的美洲倉鼠） 弗 氏 不 完 全 佐 劑（ incomplete Freunds adjuvant， IFA)， Sigma 公 司 ，可選用1?2 ml玻 璃 注 射 器（有 Luer-Lok接頭，已消毒） 三通管 IOOml燒杯 20 G 注射針頭，已消毒 1.將2 X 106?5 X 107 個 細 胞 或 1?50 ug 蛋白質或多肽置于生理鹽水中制備成抗原。如果免疫原為細胞，在接種前將細胞于無血清培養基中清洗3 次 。在 融 合 實 驗（見基本 方 案 2 ) 前 至 少 3d 準備好已免疫接種的實驗動物（足夠用于幾次的融合）。 2.使用1?2 ml玻 璃 注 射 器（有 Luer-Lok接頭）吸取抗原，連接三通管。 3.完全混勻CFA以打散結核分枝桿菌。用另一支玻璃注射器吸取與抗原液等量的CFA并連接裝有抗原的注射器（圖 1.2.1)。 4.將 抗 原 液 反 復 注 入 CFA 再 抽 出 直 至 稠 化 混 合 ，制 成 乳 狀 液 。取 50m l冷水置于IOOml燒杯中。擠出一滴乳狀液滴于冷水表面以檢測乳狀液是否穩定。如果乳狀液呈液滴狀在水面聚集，則進入步驟5。如果液滴散開則繼續混合操作直至穩定的乳狀液形成。 5.將乳狀液移入一個注射器，將另一個注射器和三通管移去。將 已 消 毒 的 20 G 注射針頭安裝于注射器上以封閉乳狀液。 6.麻 醉 大 鼠（附 錄 2D) ，或 固 定 小 鼠 或 倉 鼠（附 錄 2 0 。腹腔內注射乳狀液，劑量為(附錄2E) : 大鼠每只0.5?lml、小鼠每只小于0.2 ml、倉鼠每只0.2?0.4 ml。將針頭插入皮膚并于皮膚與腹膜壁間穿行一段距離后，再刺入腹膜腔。避免用力壓迫注射器的活塞以免過度的壓力使針頭與注射器分離，造成乳狀液的噴濺。在拔出針頭前轉動針頭以減少滲出。 7.于 10?14d 后以大約相同劑量的抗原二次免疫動物。如果計劃在免疫3d 后進行細胞融合實驗，則使用水相溶解的游離抗原或休眠期的完整細胞進行免疫。如果不立刻進行細胞融合，則 應 用 IFA (不含有結核分枝桿菌）乳化的抗原進行免疫，而不使用 CFA。 8 . 如果需要，可以于初次和二次免疫后的7?IOd用 ELISA (單 元 1 . 1 ) 或免疫沉淀法(單元12. 2 ) 測 定 抗 體 滴 度（單 元 1.2)。 展開 | 