在單克隆抗體的特異性得到充分驗證之前，應該對所有候選的雜交瘤進行建系。但為了減少不必要的工作量，可以選擇其中 2 0 個最佳的候選孔。在檢測這 2 0 個孔的培養上 清（見輔助方案1 ) 為陽性后，應該將這些孔的細胞進行凍存，同時進行有限稀釋。 附 加 材 料（其他材 料 見 基 本 方 案 2) 生 長 的 雜 交 瘤（見基本方案 2) 克隆和擴增用培養基（見輔助方案 4) 2 4 孔板 4 ml 有蓋試管，無菌 1.當 9 6 孔板中生長的雜交瘤長到 2 5 % ?5 0 % 匯 合 時（主要孔），用 無 菌 的 移 液 器（調節 為 100ul 的微量移液器）將主要孔中的細胞重懸，并將孔中全部內容物轉入 2 4 孔板的一個孔，保證有足量的細胞在此擴增孔中擴增。若是從一個長有成纖維細胞的孔中轉移細胞，應該盡早進行轉移操作，以免成纖維細胞過度生長，并且操作時切忌 刮 到 孔 底（這樣做會松動成纖維細胞）。 2.用Iml移液器在主要孔中滴入 3 滴 添 加 10 mmol/L HEPES和lmmol/L 丙酮酸鈉的DMEM-20完 全 培 養 液（見基本方案 2 , 步 驟 23)，放 回 CO2 培養箱培養。 3.用干凈的移液器取 1?1.5 ml 用于克隆和擴增的培養基加入2 4 孔 板 ， CO2 培養箱培養 2?3d。主要孔與擴增孔要用不同的移液器從不同的試劑瓶中取用培養基。 4.當 2 4 孔板中的細胞長到 2 5 % ?5 0 % 匯 合 時（2?3d)，用有限稀釋技術進行克隆操作(見輔助方案 3)。而當主要孔中的細胞長到 2 5 % ?5 0 % 匯合時，必要時可重復步驟1?30 5.完成有限稀釋操作之后，將 2 4 孔板中多余的細胞移入 4 ml無菌有蓋試管中。用添加HEPES和丙酮酸鈉的DMEM-20完全培養液繼續培養 2 4 孔板中的細胞。 6.將 前 述 4m l 管于室溫， 500 g 離 心 5 min。將上清保留以備進一步抗體鑒定或作為對照 。凍 存 細 胞 沉 淀（附 錄 3B)。如果已確定建立了穩定的細胞克隆，那么細胞建系就完成了，將其凍存，并確保可被順利復蘇。 7.如果有限稀釋操作不能培養出有抗體分泌活性的細胞系，則復蘇那些之前從 2 4 孔板中分離的細胞。將其重新在 2 4 孔板中培養，過 夜 ，并用這些細胞重新建立有限稀釋孔板。將其凍存并妥善保存。 展 | 