厭氧微生物的培養實驗

實驗方法原理 焦性沒食子酸與堿性溶液作用后，形成堿性沒食子酸鹽，在此反應過程中能吸收氧氣而造成厭氧環境；牛肉渣內既含有不飽和脂肪酸能吸收氧，又含有谷胱甘肽（glutathione）能形成負氧化還原電位差；厭氧罐是采用某種方法除去其中的氧，例如將鎂與氧化鋅制成產氫氣袋，放入罐中加水反應產生氫，鈀或鉑是催化劑，在常溫下催化氫與氧化合成水，則可除去密封的厭氧罐中的氧。

實驗材料 巴氏芽孢梭菌熒光假單胞菌

試劑、試劑盒 焦性沒食子酸棉花NaOH石蠟凡士林牛肉蛋白陳葡萄糖 NaCl肉膏蛋白胨瓊脂培養基

儀器、耗材 厭氧罐催化劑袋氣體發生袋指示劑袋試管玻璃板滴管燒瓶刀

實驗步驟

1.  焦性沒食子酸法

（1）大管套小管法在大試管中放入少許棉花和焦性沒食子酸，焦性沒食子酸的用量按它在過量堿液中能每克吸收100 ml 空氣中的氧來估計，本實驗用量約0.5 g。接種巴氏芽孢梭菌在小試管肉膏蛋白胨瓊脂斜面上，迅速滴入10%的NaOH于大試管中，使焦性沒食子酸潤濕，并立即放入除掉棉塞已接種菌的小試管斜面（小試管口朝上），塞上橡皮塞或擰上螺旋帽，置30℃培養。

（2）培養皿法取玻璃板一塊或用培養皿蓋，鋪上一薄層滅菌脫脂棉，將1 g 焦性沒食子酸放于其上。用肉膏蛋白陳瓊脂培養基倒平板，待凝固稍干燥后，在平板上一半劃線接種巴氏芽孢梭菌，下一半劃線接種熒光假單胞菌，并在皿底用記號筆作好標記。滴加10%NaOH溶液約2 ml 于焦性沒食子酸上，切勿使溶液溢出棉花，立即將已接種的平板覆蓋于玻璃板上或培養皿蓋上，必須將脫脂棉全部罩住，焦性沒食子酸反應物切勿與培養基表面接觸，以溶化的石蠟凡士林液（即vaspar）密封皿底與玻璃板或皿蓋的接觸處。置30℃溫箱培養。

2.  皰肉培養基法

（1）取已除去筋膜、脂肪的牛肉500 g，切成小方塊，置1000 ml 蒸餾水中，以小火煮1小時，用紗布過濾，擠干肉汁，將肉汁保留備用。再將肉渣用絞肉機絞碎，或用刀切碎，最好使其成細粒。

（2）將保留的肉汁加蒸餾水，使總體積為2000 ml，加入20 g蛋白陳，2 g葡萄糖，5 g NaCl和絞碎的肉渣。置燒瓶中搖均勻，加熱使蛋白胨溶化。

（3）取上層溶液調整pH為8.0，在燒瓶壁上用記號筆標明瓶內液體高度，1.05 kg/cm2，121.3℃滅菌15分鐘后補足蒸發的水量，重新調整pH為8.0，再煮沸10~20分鐘，補足水量，再調整pH為7.4。

（4）把燒瓶內容物搖勻，將溶液和肉渣分裝于小試管中，肉渣約用，應用無菌手續加入已滅菌的石蠟凡士林，以隔絕氧氣。

（5）接種前可將上述已做好的庖肉培養基煮沸10分鐘，以除去溶入的氧，如果蓋有一層石蠟凡士林，需將石蠟凡士林先在火焰邊微加熱，使其溶化。在培養基手感不燙時按液體接種法接入巴氏芽孢梭菌，然后將接種的試管垂直，使石蠟凡士林凝固而密封培養基。再置30℃中培養。

3.  厭氧罐培養法

（1）用肉膏蛋白胨瓊脂培養基倒平板，凝固干燥后，取兩個平板，每個平板一半邊劃線接種巴氏芽孢梭菌，另一半邊劃線接種熒光假單胞菌，并標記好。取其中的一個已接種的平皿置于厭氧罐的培養皿支架上，而后放入厭氧培養罐內；另一個已接種的平皿置培養室30℃培養。

（2）剪開催化劑袋，將催化劑倒入厭氧罐蓋下面的多孔催化劑盒內，擰緊催化劑盒的盒蓋。

（3）剪開氣體發生袋的切碎線處，并迅速將此氣體發生袋置罐內金屬架的夾上，再向袋中加入約10 ml 水。同時，由另一人配合，剪開指示劑袋，將指示條暴露，立即放進罐內。

（4）迅速蓋好厭氧罐的蓋，將固定梁旋緊，置30℃培養。