廈大特聘教授：如何優化乳化PCR

　　僅僅不到三十年的時間，聚合酶鏈式反應PCR席卷了生命科學研究，成為了許多生物實驗室必備的實驗技術。雖然其基本前提――擴增目的DNA樣品――不變，但近年來出現了不少創新，將這一技術發展到了許多應用領域，比如利用定量PCR分析特異性RNA轉錄的拷貝數，來確定基因表達水平。另外基因組研究的發展也促使研究人員增多了PCR的應用，比如縮小重點，遺傳信息分析縮小到單個分子或細胞，比如擴大撒網，增加單次試驗中的反應次數。

　　為了達到這些目的，研究人員采用了一種在乳化溶液中進行的高通量PCR技術，這種被稱為乳化PCR(emulsion PCR，ePCR)的方法主要通過將水相PCR溶液(包含有引物，聚合酶，核苷酸和待擴增DNA)與油混合，創建一種微小的懸浮水滴乳液。每個液滴都作為其自身PCR的“反應器”，從而創造了平行反應中的多個獨立反應。

　　廈門大學特聘教授楊朝勇博士致力于這方面的研究，他表示，這些液滴常常往往只有幾皮升的體積，能最大化聚合酶試劑比，減少大體積PCR反應中造成的浪費，大幅度提高工作效率。

　　目前市面上的很多數字PCR儀器能進行這種實驗，其優點之一在于這樣大量的獨立反應能令產物只見到交叉污染縮小到最少，并且更重要的是，乳化PCR方法能將單調乏味的實驗進化成高通量的擴大實驗。

　　不過這種方法也存在缺陷，據奧地利約翰開普勒林茨大學基因組重組研究人員Irene Tiemann-Boege稱，對于希望能進行全基因組仔細分析的研究人員來說，這種ePCR方法“產物長度很短，利用標準的PCR方法，能擴增 1-2kb”，而利用這種方法，“最長也只有150bp”。商業性的ePCR也存在所需反應量要大于一皮升的情況，因此正如加州大學伯克利分校的 Richard Novak所說的那樣，科學家們還在尋找更好的解決方法。

　　優化適體

　　適體(aptamer，也稱為適配分子)是通過體外SELEX技術從寡核苷酸隨機庫中篩選出來的，與目標分子具有高度的結合特異性的寡核苷酸序列，設計適體常常是個費力不討好的工作，要從大量可能的序列中找到適體相當耗時，這需要將候選適體序列克隆到質粒中，然后培養細菌，從中篩選適體分析的克隆。這些候選適體都需要進行測序――這一步不便宜，然后還需要進行序列比對，找到結合的好的適體，最后，研究人員還要單獨分析每個適體的結合情況，這些無疑都要花費大量人力物力和財力。

　　來自廈門大學的楊朝勇教授希望能簡化這個過程，只對優質的適體進行測序，他表示，希望能避免由于利用微珠分離分子造成離散反應的這一問題，“在(數字PCR儀器)微米通道中運轉微米大小的微珠，會造成擁堵”，他說，因為微珠在通過通道時會相互擠壓，“運轉會非常慢。”

　　為了解決這個問題，楊朝勇教授研究組拋棄了微珠的方法，采用了基于瓊脂糖的PCR。楊教授解釋道，瓊脂糖液滴本身能像微珠一樣工作，通過調整溫度就能操縱瓊脂糖由濕軟性質變成固體，再逆轉回去，因此，瓊脂糖的液滴可以方便PCR反應，也可以作為固體排列的微珠。就是利用瓊脂糖凝膠，楊教授研究組能簡單使得微珠很容易地，在超常速度下通過數字PCR儀器通道。

　　楊教授將適體分子與PCR試劑包裝在一起，瓊脂糖的多孔性能令類似溴化乙錠或SYBR Green的小分子擴散，從而能熒光標記擴增適體，然后研究人員就檢測標記的瓊脂糖珠的結合親和度，篩選合適的適體進行測序(Anal Chem, 84:350-355, 2012)。

　　瓊脂糖珠也易于操縱，“您可以使用鑷子轉移(PCR)產物，如果是乳液，你怎么能拿得起呢?”

　　作者簡介：

　　楊朝勇

　　1975年生，廈門大學特聘教授，固體表面物理化學國家重點實驗室固定成員，博士生導師。1994年進入廈門大學化學系國家人才基地班學習;1998獲得理學學士并保送研究生;2001年獲理學碩士后赴美佛羅里達大學(University of Florida)化學系攻讀博士學位，于2006年獲博士學位。2006-2007年在美國加州大學伯克利分校從事博士后研究。2008年任廈門大學化學系教授。

　　研究方向：

　　包括分子探針的設計與合成、單細胞研究、納米生物醫學工程、特異性生物分子作用研究和微流控技術在生物醫學中的應用。多年來以解決生命科學中如疾病早期診斷、人腦學習記憶機制的破譯等一系列重要問題為目標，從事單細胞水平的基因表達分析研究，先后在PNAS, J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem., NAR, Nano Lett.,Lab Chip等國際頂級學術刊物發表論文40多篇，被引用1000多次。申請國際ZL4項。

　　獲獎情況：

　　先后獲得了美國化學會分析化學研究生獎、美國Sigma　Xi科研協會研究生獎，中國政府國家優秀自費留學生獎。