雙向電泳的實驗過程

實驗概要

本實驗介紹了雙向電泳的詳細實驗過程。

實驗原理

2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點不同而將蛋白粗步分離，第二向SDS-PAGE是基于蛋白質分子量不同，而將一向分離后的蛋白進一步分離。這樣就可以得到蛋白質等電點和分子量的信息。

主要試劑

1. BSA

2. Bradford液

3. DTT

4. 0.05% 的溴酚蘭

5. IPG buffer (pH 3-10)

主要設備

1. 振蕩器

2. 高速離心機

3. 紫外分光光度計

4. 雙向電泳設備

實驗材料

純化后的晶體蛋白

實驗步驟

1. 樣品的溶解
取純化后的晶體蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振蕩器上振蕩10min左右，共處理一個小時。其中每隔10～15分鐘振蕩一次，然后13200rpm離心15min除雜質，取上清分裝，每管70ul，-80^oC保存。
2. Bradford法測蛋白含量
取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超純水溶解,測定BSA標準曲線及樣品蛋白含量。
取7個10ml的離心管，首先在5個離心管中按次序加入0ul,  5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分別加入2  ul的待測樣品溶液，再在每管中加入相應體積的雙蒸水（總體積為80ul），然后，各管中分別加入4ml的Bradford液（原來配好的Bradford液使用前需再取需要的劑量過濾一遍方能使用），搖勻，2min在595nm下，按由低到高的濃度順序測定各濃度BSA的OD值，再測樣品OD值。(測量過程要在一個小時內完成)。例如：
編號   蛋白量（ul）  Buffer(ul)   Bradford(ml)  OD595值
1                0                    80                4                0
2                5                    75                4              0.024
3               10                   70                4              0.061
4               15                   65                4              0.091
5               20                   60                4              0.116
Bt4              2                   78                4              0.079
Bt4              4                   76                4       
轉Bt4           2                  78                4              0.075
轉Bt4           4                  76                4       
標準曲線方程式：Y= aX b.其中Y為 OD值，X為蛋白含量。 a、b通過作圖輸入數據可知，相關系數通過輸入數據，作圖，軟件分析可得。
OD值測量過程：
比色皿用70%的乙醇保存，待用時用雙蒸水沖洗，再用無水乙醇沖洗，雙蒸水沖洗，再加入待測樣品溶液潤洗，然后，加入樣品，測定OD值。
3. 雙向電泳第一向---IEF（雙向電泳中一律使用超純水）
   1) 水化液的制備
稱取2.0mg  的DTT，用700ul水化液儲液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚蘭，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer (pH  3-10)振蕩混勻，13200rpm離心15min 除雜質，取上清。在含300ug  蛋白（經驗值）的樣品溶解液中加入水化液，至終體積為340ul，振蕩器上振蕩混合,13200rpm離心15min除雜質，取上清。
   2) 點樣，上膠
分兩次吸取樣品，每次170ul,  按從正極到負極的順序加入點樣槽兩側，再用鑷子撥開Immobiline  DryStrip gels (450px，pH  3-10)膠條，從正極到負極將膠條壓入槽中,膠面接觸加入的樣品。注意：膠條使用前，要在室溫中平衡30分鐘；加樣時，正極要多加樣，以防氣泡的產生；壓膠時不能產生氣泡；酸性端對應正極，堿性端對應負極；樣品加好后，加同樣多的覆蓋油(Bio-Rad)，兩個上樣槽必須與底線齊平。
   3)  IPG聚焦系統跑膠程序的設定（跑膠溫度為20^oC）
S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)
S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)
S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)
S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)
S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step)       共計44110vhs, 19.5小時,其中S1用于泡脹水化膠條，S2和S3用于去小離子，S4和S5用于聚焦。
   4) 平衡
用鑷子夾出膠條,超純水沖洗后，在濾紙上吸干（膠面，即接觸樣品那一面不能接觸濾紙，如果為450px的膠條要將兩頭剪去），再以超純水沖洗，濾紙吸干（再次沖洗過程也可省略），然后用鑷子夾住膠條以正極端（即酸性端）向下，負極端（即堿性端）向上，放入用來平衡的試管中（鑷子所夾的是堿性端，酸性端留有溴酚蘭作為標記），用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。  注:平衡時要注意保持膠面始終向上,不能接觸平衡管壁。
平衡第二次時，在沸水中煮Marker 3min,剪兩個同樣大小的小紙片，長度與一向膠條的寬度等同，然后吸取煮好的Marker，轉入SDS—PAGE膠面上，保持緊密貼合；同樣在第二次平衡時，煮5%的瓊脂糖10ml。
4. 雙向電泳第二向---SDS-PAGE
   1) 配膠(兩根膠條所用劑量)
分離膠：（T=8%  80 ml）：溶液于真空機中抽氣后再加APS和TEMED
30 % 丙烯酰胺儲液    21.28ml

分離膠buffer          20ml      10%APS 220ul     TEMED 44 ul

雙蒸水               38.72ml
濃縮膠：（T=4.8%   10ml）
30 % 丙烯酰胺儲液    1.6ml

濃縮膠buffer          2.5ml     10%APS 30ul     TEMED 5ul

雙蒸水               5.9ml
   2) 灌膠

將玻璃板洗凈后,室溫晾干,然后,將電泳槽平衡好,玻璃板夾好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏膠,倒入正丁醇壓膠,凝膠后(這時會出現三條線),用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再用濾紙除水后,倒入濃縮膠,正丁醇壓膠,凝膠后,用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再加入超純水,用保險膜封好。
   3) 轉移

剪兩個小的濾紙片，吸取Marker后，放入SDS—PAGE膠面的一端。然后，將平衡好的IPG膠條貼靠在玻璃板上,加少量的5%的瓊脂糖溶液在膠面上(瓊脂糖凝膠在轉移前十幾分鐘的時候配好,水浴加熱溶解,并保持燒杯中水處于沸騰狀態,至用之前再拿出來),再將IPG膠條緩緩加入SDS—PAGE膠面,其中不斷補加5%的瓊脂糖溶液,注意不能產生氣泡。
   4) 跑膠

濃縮膠  13mA         分離膠  20mA        共約5.5個小時。
5. 銀染(兩根膠條所用劑量)（銀染特別注意用超純水）
   1)  固定   30min    無水乙醇 200ml 乙酸50ml，用超純水定容至500ml。
   2)  敏化   30min    無水乙醇 150ml。
Na₂S₂O₃?5H₂O  1.5688g

無水乙酸鈉          34g  

先用水溶解Na₂S₂O₃?5H₂O和乙酸鈉,再加乙醇,最后定容至500ml。
   3)  洗滌   5min  ×  3次
   4)  銀染   20min     AgNO₃   1.25g   用超純水定容至500ml
   5)  洗滌   1min  ×  2次
   6)  顯影      

無水Na₂CO₃    12.5g   用超純水定容至500ml，甲醛(37%)0.1ml, 臨時加。
   7)  終止   10min     EDTA—Na2?2H2O  7.3g  用超純水定容至500ml。
   8)  洗滌   5min  ×  3次。

注意事項

整個雙向電泳實驗中全部使用超純水，盡量減少離子的影響。