雙向電泳的新進展和新工具

　　隨著蛋白質組學概念的提出，雙向電泳(2D gel electrophoresis)一度曾變得很流行。近幾年，因質譜技術的快速發展，LC-MS的熱度似乎更高。然而，在某些應用上，雙向電泳更有優勢。

　　雙向電泳提供了整個樣品的鳥瞰圖，而這是質譜無法比擬的。它可以對樣品中復雜的蛋白質進行整體性的分離，是目前唯一可以在一塊凝膠上同時分離成千上萬個蛋白質的方法，且分離得到的蛋白質組分的純度可以達到90%以上。通過它，您可以研究和比較蛋白質組在某些條件下如何變化。

　　此外，雙向電泳分離完整的蛋白，而大部分質譜方法都是研究肽段。因此，開展質譜分析的研究人員很難確定翻譯后修飾事件，如兩個不同的翻譯后修飾是同時存在，還是互相排斥。當然，這兩種技術在費用和設備要求上也不能同日而語。雙向電泳的設備與質譜儀相比，簡直是小巫見大巫。而且，質譜儀還需要專門的人員來操作，沒有一定的經驗可不敢貿然出手。

　　當然，雙向電泳的重復性也是個無法回避的問題。不過，隨著技術的不斷發展，研究人員也能夠克服這一挑戰，發表漂亮的結果。

　　唐氏綜合征研究

　　英國普利茅斯大學的資深研究員Tracey Madgett曾利用雙向凝膠電泳來鑒定唐氏綜合征(Down Syndrome)的生物標志物1。據Madgett介紹，采用電泳方法的決定是基于科學和實際的考慮。首先，其他人已采用雙向電泳來研究唐氏綜合征。更重要的是，她們有雙向電泳的設備，但缺乏LC-MS的經驗。

　　Madgett及其同事的研究對象是懷孕頭三個月或4-6個月的孕婦，她們懷有一個正常的胎兒或患有唐氏綜合征的胎兒。研究人員從她們身上抽取血漿，經處理后開展雙向凝膠電泳。

　　每個樣品經過處理后獨自跑膠、染色和分析。然而，凝膠之間的差異無法避免。這樣就很難通過比較凝膠上的斑點強度來區分差異表達的蛋白。兩塊膠上的同一位置，也許根本就是兩個不同的蛋白，這怎么比較?

　　為了克服這一問題，GE Healthcare在大約十年前開發出一種多重分析技術，稱為熒光差異凝膠電泳(2D DIGE)。2D DIGE的基本實驗線路是電泳前以Cy2、Cy3 和Cy5三種熒光染料分別標記蛋白質樣品(其中包括一個蛋白質內標)。然后將標記好的蛋白質樣品混合，在同一塊膠上進行雙向電泳。電泳結果分別用3種不同的激發波長得到不同顏色的熒光信號，根據這些信號的比例來判定樣品之間蛋白質的差異。

　　2D DIGE技術第一次在雙向電泳中引入了內標。DIGE的內標是將試驗中所有樣品取等量混合，單獨用一種熒光染料(在最小標記染料中通常是Cy2)標記，和所有樣品一起電泳。這意味著所有樣品中的蛋白質點都會有對應的內標。由于所有樣品在電泳過程中經過相同的處理，那么研究人員可準確地鑒別不同條件下的蛋白豐度差異;他們只需收集三幅熒光圖像，利用數據分析軟件比較即可。

　　Madgett和她的研究小組就利用2D DIGE來開展唐氏綜合征的生物標志物分析。研究人員首先利用QIAGEN的Qproteome Albumin/IgG Depletion Kit去除了白蛋白和IgG這兩種高豐度蛋白。之后她們在3塊24 cm的2D凝膠上跑膠，這三塊凝膠的差別在于第一向等電聚焦時的pH不同。第一塊覆蓋pH 4.5-5.5，第二塊覆蓋pH 5.3-6.5，第三塊覆蓋pH 6-9。研究人員認為，窄范圍比寬范圍的IPG膠條(如pH 3-10)的分辨率更高。

　　Madgett表示，通過此次分析，她們在4-6個月的血漿中找到了7個“有希望的線索”。她們將這些斑點切下來，并進行各種質譜分析，來鑒定這些蛋白。Madgett認為她們還需要在更大的隊列人群中驗證這些線索。談到2D DIGE，她表示：“這很復雜，但最后獲得了結果，我很激動。我還會做的。”

　　新工具

　　作為一種很經典的技術，雙向電泳仍在不斷發展。盡管人們想用新技術來取代它，但是若希望對蛋白質組有全面的認識，其他技術在分辨率和靈敏度上仍然與雙向電泳有差距。近幾年，從樣品制備到數據分析，也有不少新的產品面市。

　　樣品制備

　　對于雙向電泳而言，樣品制備是個關鍵。等電聚焦對污染物(如核酸和脂類)格外敏感，因此如果您想得到一張漂亮的電泳圖，那么必須先去除污染物。多家公司都提供這種樣品純化試劑盒。GE Healthcare的 2-D Clean-Up Kit能高效去除污染物，如鹽、脂類和核酸。而上文提到的QIAGEN試劑盒也能去除高豐度蛋白。

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　　有時，僅僅去除高豐度蛋白還不能解決問題，這時，您可能需要進一步降低樣品復雜度。如果您關注蛋白質組中的特定部分，那么您可以分步分離復雜蛋白，例如分離細胞核、細胞質和膜蛋白，或者分離磷酸化蛋白或糖基化蛋白。默克密理博就提供這種分步分離的試劑盒。

　　另外，Life Technologies也提供一種ZOOM? IEF Fractionator，能將蛋白迅速濃縮至5個等電點范圍內。它的原理和操作都很簡單，即在ZOOM? IEF Fractionator樣品槽(chamber)之間放置一個個Disk，就可以在一個特異的pH值范圍進行分離。例如，如果您想要分離pH值范圍在 pH4.6到pH5.4之間的蛋白，只需連接一個用pH4.6和pH5.4 Disk分隔的樣品槽即可。這種液相的等電聚焦裝置便于樣品的回收，而且Disk是一次性的，減少了交叉污染的可能性。Bio-Rad也提供了類似的裝置，名為Rotofor Cell，規格多樣，但貌似用起來稍微復雜一點，而且價格更貴。

　　等電聚焦

　　在雙向電泳中，為了獲得最佳的電泳結果，我們必須不斷優化樣品制備和第一向等電聚焦的條件，以確保復雜的樣品能夠充分分離。而不同蛋白樣品的最佳IEF條件可能相差甚遠，因此必須單獨摸索。

　　市場上大部分IEF系統都有多個通道，但各個通道的條件都是相同的，因此每次只能摸索一個條件。而傳統的 IEF槽將總電流平均分到所有通道。除非所有的樣品有著相同的電導率，否則電流是不能平均分配的，最終每個膠條上的電流可能未達到或超過了理想的電流。這有可能引起聚焦不足或聚焦過度。

　　而Bio-Rad新推出的PROTEAN i12 IEF系統擁有12個獨立通道，且每個通道都有自己的電源。這樣，系統就能同時運行不同的樣品類型、不同的聚焦條件以及不同pH范圍的膠條，而不用擔心不同樣品會互相影響。這種獨特的能力讓您能在更短的時間內優化實驗，提高實驗效率，同時獲得穩定的結果。對于有多個雙向電泳課題的實驗室而言，這確實是個好消息。

　　GE Healthcare的Ettan 2D系統也有兩個新成員：IPGbox? 和IPGbox Kit。IPGbox的設計經過改進，底座和上蓋可以分離，更加友好和穩定，且不透明的蓋子讓水化在暗處進行，完全適合光敏感的CyDye DIGE熒光染料。上蓋和插片的設計可保證膠條在水化過程中不會變干，無需再用覆蓋油。同時一次性使用的水化盤和插片，也保證樣品之間沒有交叉污染。水化盤經過重新設計后，高疏水性材料保證溶漲液不會粘附在盤上，且水化液均勻分布在整個盤內，確保IPG膠條水化的一致性。

　　染色

　　對于2D凝膠的染色，銀染是比較常用的方法，不過步驟多，流程長，操作復雜。而SYPRO Ruby熒光染料的出現被譽為蛋白質組研究中的里程碑。它的靈敏度可與最好的銀染法相媲美(1~2 ng)，線性動態范圍可達3個數量級，而且它與質譜檢測和Edman測序有很好的兼容性。SYPRO Ruby可一步檢測蛋白，只需要30~60 min，不需要脫色步驟，相當方便。

　　目前有多家公司都提供樣品制備試劑盒、IPG膠條、IEF電泳裝置和第二向跑膠裝置，包括GE Healthcare、Bio-Rad、Life Technologies等。但對于剛入門的同學來說，他們也許會糾結兩個問題。

　　選擇哪種膠條?

　　IPG膠條有多個pH范圍可供選擇，從寬到窄。例如，Bio-Rad的IPG膠條覆蓋“寬”(3-10)、 “窄”(3-6、5-8、4-7)和“更窄”(3.9-5.1、4.7-5.9、5.5-6.7、6.3-8.3)的pH范圍。建議在寬范圍分析完成之后，再進行窄范圍的分析。如果是研究一個未知樣品，寬的pH范圍將帶來一個樣品概覽。在您了解目的蛋白的大致位置后，才建議使用窄或更窄的pH梯度。

　　選擇多大的膠?

　　選擇多大的膠，這也是個問題。各家公司的2D凝膠大小不等，從9 cm x 7 cm一直到24 cm x 20 cm，而IPG膠條的長度也從7 cm到24 cm。一般來說，凝膠越大、運行時間越長，但分辨率越高。而另一方面，太大的膠很難操作。這就如同一個硬幣的正反面，很難取舍。不過，如果你對自己的體力有信心，那就勇敢地使用大膠吧。