雙縮脲法測蛋白質中該如何校正實驗結果

具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應。在堿性溶液中雙縮脲與銅離子結合形成復雜的紫紅色復合物。而蛋白質及多肽的肽鍵與雙縮脲的結構類似，也能與銅離子形成紫紅色配位化合物，其最大光吸收在540nm處。其顏色深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質的相對分子質量及氨基酸的組成無關，該法測定蛋白質的濃度范圍適用于1~10mg/mL，雙縮脲法常用于蛋白質的快速測定。

①雙縮脲法：A540-蛋白質濃度標準曲線

②紫外吸收法：A280-蛋白質濃度標準曲線
實驗操作：
取雙縮脲試劑、10mg/mL的標準蛋白溶液和待測蛋白溶液（稀釋10倍的人血清），按下表配制6支溶液：

紫外吸收測定法
目的要求：
了解紫外吸收法測定蛋白質含量的原理。
掌握紫外分光光度計的使用方法。
實驗原理：蛋白質分子中所含酪氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵，使蛋白質在280nm 波長處有最大吸收值。在一定濃度范圍內，蛋白質溶液的光吸收值（A280）與其含量成正比關系，可用作定量測定。紫外線吸收法測定蛋白質含量的優點是迅速、簡便，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此。廣泛應用在柱層析分離中蛋白質洗脫情況的檢測。此法的缺點是∶①對于測定那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質，有一定的誤差;②若樣品中核酸等吸收紫外線的物質，會出現較大的干擾。不同的蛋白質和核酸的紫外線吸收是不同的，即使經過校正，測定結果也還存在一定的誤差。但是可作為初步定量的依據。該法可測定蛋白范圍應在0.1～1.0mg/mL。
試劑和器材：1.標準和待測蛋白質溶液（1)標準蛋白溶液：結晶牛血清蛋白，預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度配制成1mg/mL蛋白溶液。（2)待測蛋白質溶液：人血清，使用前稀釋100倍。2.器材
試管1.5cmx15cm(x9);試管架；移液管1mL(x3),2mL(x2),5mL(x2);分光光度計。
操作方法：1.制作標準曲線

取8支試管編號，按下表分別向每支試管加入各種試劑，搖勻。選用光程為1cm的石英比色杯，在280nm波長處分別測定各管溶液的A280值。以A280值為縱坐標，蛋白質濃度為橫坐標，繪制標準曲線。
注意事項：
由于各種蛋白質含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質的相對濃度（相對于標準蛋白質）。此外，蛋白溶液中存在核酸或核苷酸時也會影響紫外吸收法測定蛋白質含量的準確性。
三、標準曲線的繪制與蛋白質的濃度計算
曲線如上圖①，②。
雙縮脲法：所配制溶液（0.5mL十倍稀釋血清被稀釋成1mL）蛋白質濃度為4.27mg/mL，稀釋10倍的血清中蛋白質的濃度為4.27*2mg/mL，原血清中蛋白質濃度為4.27*2*10=85.4mg/mL。
紫外吸收法：所配制溶液（1mL稀釋百倍血清被稀釋成4mL）蛋白質濃度為0.377mg/mL，稀釋100倍的血清中蛋白質的濃度為0.377*4mg/mL，原血清中蛋白質濃度為0.377*4*100=150.8mg/mL。
四、結果分析與討論
用雙縮脲法測定的血清中蛋白濃度為85.4mg/mL，用紫外分光光度法測定的血清中蛋白濃度為150.8mg/mL。結果相差較大，現討論如下：
雙縮脲法的原理為銅離子與蛋白質形成有色復合物顯色，受非蛋白物質影響小，而且其結果接近人血清中蛋白濃度正常范圍60-80mg/mL，結果較為可信；而紫外吸收測定法測定人血清遠超正常范圍，準確度很低。經查閱相關文獻資料，發現當樣品中含有嘌呤、嘧啶等核酸類吸收紫外光的物質，在280 nm 處來測量蛋白質含量時，會有較大的干擾，即增大吸收度，使得測定的蛋白質濃度偏大，人血清樣品含較多核酸類物質，符合此描述，可以認為是人遺傳物質帶來的干擾。再次查閱文獻資料得知，要減小核酸類物質對蛋白質濃度的測量的干擾，需要利用核酸在 260 nm 處的光吸收比 280 nm 更強，而蛋白質與此相反的性質，利用 280 nm 及 260 nm 的吸收差來計算蛋白質的含量，相應的也形成了校正表，具體測算時應當對照校正表計算。
五、思考題
干擾雙縮脲法測定蛋白質濃度實驗的因素有哪些？①樣品中自帶的類脂及色素干擾比色。②不同堿性條件下蛋白質濃度線性相關性不同。③硫酸銨，EDTA，一些氨基酸等干擾銅離子的反應。
（2）紫外吸收測定法測定蛋白質含量時，若樣品中含有核酸類雜質，應當如何校正實驗結果？①用離子層析柱進一步提純樣品，減少樣品中核酸類物質含量。②可以使用查校正表，再進行計算的方法，加以適當的校正以減少核酸的干擾，但是因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經過校正，測定的結果還是存在一定的誤差。