雙脫氧鏈終止法測定DNA序列

[目的]

掌握雙脫氧鏈終止法測定DNA序列的原理與方法

[原理]

DNA聚合酶催化的DNA鏈延伸是在3’-OH末端上進行的。由于2’，3’-雙脫氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的3’-位脫氧而失去游離-OH，當它參入到DNA鏈后，3’-OH末端消失，使DNA鏈的延伸終止。

本實驗根據此原理，將待測DNA片段插入單鏈噬菌體M13載體，并用合成的寡聚核苷酸引物與該載體上插入待測片段的上游順序退火，隨后在T7DNA聚合酶催化下進行延伸反應。實際操作中同時進行，分別終止于A、G、C和T的4個反應體系。

每個反應體系均含4種脫氧三磷酸核苷酸(dNTP)底物，其中—種dATP為32P標記物，以便能用放射自顯影法讀序。但在這4個反應體系中，分別加一種低濃度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)，這樣ddNTP可隨機參入正在延伸的DNA鏈上，使鏈延伸終止。

例如在“A”管中加ddATP，反應結束時，管內所有新合成的DNA鏈都是以A結尾的不同長度的片段，而且這些片段都帶放射性。將反應物加在高分辨凝膠上電泳，DNA片段則因其長度不同(分子量大小不同)被分離，短的走在前端，長的泳動在后面。其他3管則分別為以G，C或T結尾的不同長度DNA片段。

由于：①即使是長短相差一個核苷酸的DNA片段，亦可根據其電泳距離的差異而加以區分；②A、G、C和T4種反應體系的產物在電泳凝膠中相鄰排列。故而在閱讀凝膠電泳的放射自顯影圖像時，由下至上按前后順序即可將DNA的核苷酸順序讀出。

[操作]

1．單鏈模板與引物退火

(1)用無菌蒸餾水按1：5稀釋通用引物(約4.44μg/ml)。

(2)取1.5ml微量離心管1只，加入下列試劑：模板DNA(1.5-2ugDNA/10μl)10μl；稀釋通用引物2μl；退火緩沖液2μl,總體積14μl。

2．鏈延伸/終止反應

(1)稀釋T7DNA聚合酶：取2μl(或4μl)冷的酶稀釋緩沖液至1只微量離心管中，加入0.5μl(或lμl)T7DNA聚合酶，用加樣器輕輕抽吸和排出而混勻，置冰浴中待用。

(2)另取4只微量離心管，分別用記號筆標明“A”、“G”、“C”和“T”。依次將A-Mix、G-Mix、C-Mix和T-Mix液各2.5μl分別加入這4只微量離心管中，置37℃預溫1分鐘以上 (說明：4種mix液各又分為short和long兩種，前者中ddNTP濃度較高，用于<500bp的DNA片段的測序，后者用于50-1000bp片段的測序。一般應用short即可)。

(3)標記反應：在操作(1)的微量離心管中加入下列試劑：模板/引物14μl(已有)；標記用混合物(1abellingmix)3μ1；已標記混合物(1abelled mix)1μ1，T7DNA聚合酶稀釋液2μ1。總體積20μ1。

輕輕混勻，簡短離心，置室溫5分鐘，立即接下步反應。

(4)從“標記反應”混合物中，分別取4.5μl加于4只預溫的反應液中(注意：每一次轉移均應換用新的吸頭)，輕輕混勻。簡短離心，37℃保溫5分鐘。

(5)向每只離心管中加入5μl反應終止液，混勻，簡短離心。

(6)變性反應：在電泳前進行。在上述鏈延伸反應終止后，最好即時進行變性反應并電泳，如不能及時電泳，終止反應后樣品可儲于冰浴或4℃。

另取4只微量離心管，標好“A”、“G”、“C”和“T”。從上述每一鏈延長/終止反應的試管中取3μ1，分別加入4只已標號的相應微量離心管中，75-80℃加熱2分鐘，立即各取1.5-2μ1點樣、電泳。