反轉錄病毒原液檢測實驗

病毒細胞

polybrene 小牛血清 DMEM

培養皿 濾膜

1.  在開始分析的前1天，按1：50將NIH 3T3細胞分傳于3個6 cm 培養皿中。將1個培養皿標記為陽性對照，1個為陰性對照，1個用于待測病毒原液。

2.  含有選擇標記的待測病毒的制備：加0.01 ml 800 μg/ml polybrene至1 ml 待測病毒上清中，通過0.45 μm 濾器過濾。

3.  含有選擇標記的陽對照的制備：制備1 ml 無輔助病毒的病毒原液與10~100 CFU輔助病毒原液的混合液。加0.01 ml 800 μg/ml polybrene，通過0.45 μm 濾器過濾除菌。

4.   陰性對照病毒原液的制備：制備1 ml 無輔助病毒的病毒原液，加0.01 ml 800 μg/ml polybrene，通過0.45 μm濾器過濾除菌。

5.  用各病毒原液感染培養皿上的細胞。將感染后的3個培養皿置于37℃ CO₂培養箱中溫育1~3 h以利于吸收，加4 ml DMEM-10培養至細胞匯片。

6.  將細胞按1：50分傳于新的6 cm 培養皿中。3個培養皿中每個僅傳一個培養皿，棄去原來感染的細胞的無用的部分。使polybrene的終濃度在2 μg/ml 培養至細胞長到50%~90%匯片。

7.  棄去培養液換以半量的新鮮DMEM-10。再培養2~3天。

8.  收獲生長匯片的細胞的最終的上清。經0.45 μm 濾膜過濾，加polybrene至終濃度8 μg/ml。保存于-70℃~ -80℃，或立即用于滴定及分析標記抗性。

9.  在上清滴定前1夭，將新鮮的未經感染的NIH 3T3細胞按1：10或1：20分傳于3個6 cm  培養皿中。用各種上清1 ml 感染口NIH 3T3細胞，并進行滴定的各步操作。如果出現了幾千個neo抗性的克隆就說明原始的待測病毒原液中污染了輔助病毒。