葉綠體色素的分離（柱層析法）

原理

吸附劑如蔗糖、Al2 O3 、MgO、CaCO3 等對各種物質有不同的吸附力，吸附力的大小隨吸附劑的種類而異；同一吸附劑在不同的溶劑中吸附力的大小也不同。被吸附的物質由于其結構中極性基團的種類和數量不同，吸附力也不相同。

各種官能團的極性大小次序為；－CH2 －CH2 －＜－CH=CH＜－CH=CH－CH=CH－＜－OCH3 ＜－COOR－＜－C=O＜－CHO＜－SH＜－NH2 ＜－OH＜－COOH。

本實驗是把蔗糖粉末填入玻璃管中（壓成柱狀）作為吸附劑，將葉綠體的石油醚提取液傾于吸附柱上，色素即被吸附。

由于色素的種類不同，被吸附的強弱不同，就在吸附柱上排列成為不同的色層，再利用吸附劑在不同溶劑中有不同的吸附力，用不同的溶劑進行洗脫，從而達到葉綠體主要的4種色素（葉綠素a、葉綠素b、葉黃素、胡蘿卜素）的分離。

儀器藥品

銅篩 　　　　　真空泵

過濾瓶 　　　　分液漏斗

研缽 　　　　　量筒

具塞三角燒瓶 　小漏斗

螺旋夾 　　　　乳膠管

層析柱（直徑1梍1.5cm，長約15梍20cm）_

石油醚　　　　 丙酮

無色汽油 　　　苯

乙醚 　　　　　碳酸鈣

氯化鈉

蔗糖：將蔗糖磨細，過篩（篩孔0.10mm），為增強吸附力，使用前需在70─75℃下烘2小時。

操作步驟

1．色素的提取

稱取綠色組織2g，棄去粗大葉脈后剪成碎塊，放在干凈的研缽內，加入少量碳酸鈣和石英砂，以及少量丙酮（干材料用85%丙酮，新鮮材料用無水丙酮），研磨成勻漿。減壓過濾，濾液收集于量筒中，殘渣再用丙酮洗滌數次，直至無色，定容20ml。提取液經反射光照射應觀察到血紅色熒光。

丙酮提取液中不僅有葉綠體的色素，而且也有能溶于丙酮中的化合物，為了更好地分離色素，必須用石油醚純化色素。

純化色素時將丙酮提取液轉入分液漏斗中，加等量石油醚，輕輕搖動，再加等量飽和NaCl溶液振搖，再加等量蒸餾水振搖，放置分層。待明顯分為兩層，上層為深綠色石油醚層，有顯著的熒光性。小心地把下面的丙酮水液層放掉，用洗瓶沿漏斗壁以水洗滌石油醚層6─7次，以徹底洗去丙酮。定容為20ml，所得石油醚色素提取液置于棕色瓶中待用。

2．吸附柱的制備

(1) 干法裝柱

把層析柱的玻管部分固定在抽濾瓶上，在玻管的基部用清潔的脫脂棉填上，使松緊合適，于其上放一大小合適的圓形濾紙片，柱的上端放一小漏斗，取烘過的蔗糖粉由小漏斗裝入柱中，邊裝邊輕敲柱外壁，隨后進行抽氣，使蔗糖柱緊實，約為15cm長。

裝好吸附劑后于其上輕輕蓋上一片大小合適的圓形濾紙，小心地注入石油醚，抽濾，當蔗糖柱全部被石油醚浸濕，且在柱上面留有少量石油醚時，停止抽吸。

(2) 濕法裝柱

層析柱用夾子垂直固定于鐵架上，下端套上一段乳膠管，在乳管的另一端套上一玻璃管，在乳膠管上夾一螺旋夾，以控制流速。柱子下端同樣填上脫脂棉，放上小濾紙片，柱上放一小漏斗。先關閉螺旋夾，注入一定體積的石油醚于柱中，打開螺旋夾，讓石油醚以每秒1滴的流速流下，當注入的石油醚流至柱的3/4處，從小漏斗緩緩裝入蔗糖粉，抽吸，并在蔗糖柱上蓋一濾紙片，待石油醚快流完時，停止抽吸。

3．色素的分離

將色素提取液2ml傾入吸附柱上，當色素提取液將要全部進入蔗糖柱中，加入一定體積的石油醚沖洗，抽吸，至柱上的顏色快要擴展到吸附柱的下端時，就在柱上出現不同顏色的色帶，上面是黃綠色的葉綠素b，其次是藍綠色的葉綠素a，再下面是黃色的葉黃素，胡蘿卜素沒有被蔗糖吸附，出現在柱的最下端或隨洗脫劑石油醚進入抽濾瓶中。

4．色素的洗脫

分布在柱上各色帶的位置彼此很接近，為了更好地分離，需將各色帶分開有較大的距離。

為此可加入10─15ml汽油—苯的混合液）（10∶1），抽濾，混合液滲入后，胡蘿卜素從吸附柱上全部排出，葉黃素與葉綠素a分開，并逐漸被洗脫下來。這時再加入汽油—苯的混合液（1∶2），抽濾，葉綠a和葉綠素b更清楚地分開，葉綠素a被洗脫，葉綠素b可用乙醚（或乙醇）洗脫。

注：為了更好地觀察葉綠體的4種主要色素，可在柱子的最下端裝入中性氧化鋁，約占柱長的1/5，上面再裝蔗糖，制成吸附劑的混合柱，這樣從上到下為葉綠素b，葉綠素a，葉黃素和胡羅卜素，4種色素會很好地分離。