哺乳動物細胞抽提物中熒光素酶的測定

螢光素酶是理想的報告基因，因為哺乳動物細胞中不含內源性螢光素酶，一旦轉錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶，同時在所有的化學發光反應中，它的光產物具有最高的量子效率，檢測靈敏度高。熒光素酶報告基因被廣泛用于miRNA靶基因驗證。

熒光素酶報告基因的原理在于miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用，可以將目的基因3’UTR區域構建至pGL3-basic載體中報告基因Luciferase的后面，構建熒光素酶質粒。然后轉染至細胞中，通過比較過表達或者干擾miRNA后，檢測報告基因表達的改變（監測螢光素酶的活性變化）可以定量反映miRNA對目的基因的抑制作用。結合定點突變等方法進一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點。

DNA 轉染的哺乳動物培養細胞

細胞裂解緩沖液熒光素酶測定緩沖液熒光素溶液不含鈣鹽和鎂鹽的磷酸鹽緩沖液

熒光光度計和光度計測置管橡膠棒

1. 轉染后 24-72 h, 室溫下用不含鈣鹽和鎂鹽的磷酸鹽緩沖液（PBS） 洗細胞 3 次。PBS 換液時要輕緩，因為有些哺乳動物細胞（如人胎腎 293 細胞）在劇烈吹打時很容易從培養皿上脫落下來。通常，熒光素酶基因在轉染細胞中獲得最大表達量的時間是 24-72 h。

2. 每個 100 mm 培養皿中的轉染細胞，加入 lml 冰冷的裂解緩沖液。緩沖液輕輕旋轉， 然后用橡膠棒把裂解細胞從培養皿上刮下來。細胞裂解物轉移到 1.5 ml 離心管中。

3. 細胞裂解物在 4°C 以最大速度離心 5 min。把上清小心地轉移到另一個新的 1.5 ml 離心管中。

4. 用 Bradford 測定等快速比色法確定裂解物的蛋白濃度。在測定蛋白濃度前，為了防止干擾，把 TritonX-100 的濃度稀釋到小于等于 0.1%。這步中，細胞裂解液可以分成小份， 貯存在-70°C。雖然貯存在或-20°C 時，熒光素酶在裂解緩沖液中不穩定（Brasier et al.1989）， 但是在含 15%（V/V）甘油和 1%（m/V） 牛血淸白蛋白的緩沖液中，該酶可以在 4°C 安全貯存。

5. 敲打盛有裂解物的管子的管壁，輕輕使裂解物混合。室溫下，在每個含有 360ul 熒光素酶測定緩沖液的熒光光度計管中加入 5-200ul 細胞裂解液。管子放入熒光光度計。

除了可使用熒光光度計測量熒光素酶活性，還有另一種方法在欄目替代方案：用閃爍計數器測量熒光素酶活性。

6. 測定開始，200ul 熒光素溶液加到熒光光度計管中，然后在室溫測量 2-60s 時間內的光輸出。測光輸出時間的最佳長短要根據經驗確定，而且與轉染細胞的類型以及所用的特殊底物和熒光素酶有關。

7. 測定每個管子產生的相對光單位數，并確定測量的線性范圍。使用適當量的細胞裂解蛋白，使它在隨后測量中產生的值位于線性范圍的中部。根據所研究啟動子的強度以及每次實驗的轉染效率，所需蛋白的量會有變化。細胞裂解物中熒光素酶活性可以用相對光單位數或毫克表示。

熒光素是能夠受熒光素酶催化發光的底物的通稱。常用的熒光素酶基因來自螢火蟲，它作用于特定的熒光素底物。其他如來自海三色堇或某種海洋細菌的熒光素酶所使用的熒光素底物具有不同的化學性質。確定前面緩沖液中所用的熒光素底物確實與表達質粒中的熒光素酶基因相匹配。

為了減少內在的變化因素，比如：培養細胞的數目、細胞轉染和裂解的效率等對實驗準確性的影響，將帶有熒光素酶基因的質粒作為對照質粒與報告基因質粒共轉染細胞，提供轉錄效率的內對照，使測試結果不受實驗條件變化的干擾。在測量過程中，首先加入熒光素酶檢測試劑時產生螢火蟲熒光信號，這樣先測量螢火蟲熒光素酶活性。定量螢火蟲熒光強度之后，再在同一樣品中加入Stop&Glo Reagent試劑，將上述反應淬滅，并同時啟動海腎熒光素酶反應，進行第二次測量，稱之為雙熒光素酶報告基因實驗。