固相化pH梯度雙向凝膠電泳實驗

鼠肝

二硫蘇糖醇（DTT) 抽提溶液 苯甲基硫酰氟（PMSF)

液氮 低溫離心機 研缽和研杵

1.取一些肝放入研缽中，如果事先沒有被冰凍，可用液氮充滿研缽來保持肝冰凍。用研杵將肝破碎成小塊。

2.稱量冰凍肝的小塊 10~40 mg，將其轉移至在冰上放置的離心小管中。操作應迅速以盡可能減少肝樣品的解凍。將剩余的肝儲存在一 80°C。

3.在有肝樣品的離心管中，每 40 mg 肝加入 1ml 冷的抽提溶液。每 1ml 抽提溶液加 100 mmol/L PMSF。

4.用小研杵（其大小適合在離心管中使用）磨碎肝樣品。

5.每 1ml 抽提物中加 50ul 1.2mol/L DTT，振蕩。

6.在 4°C 對樣品進行最大速度離心，lOmin。

7.檢測上清的蛋白質濃度。

8.將上清分成每 100ul —份。若不立即用于 IEF，將其儲存在一 80°C(樣品只能凍融一次，以避免多次凍融造成的不利影響）。

9.按照方案 5 進行第一向 IEF。

進行第一向 IEF 時，以鼠肝為例，濃度應為 5~lOmg/ml。對第一向 IEF，樣品可在包含 7mol/L 脲、2mol/L 硫脲、20 g/LASB-14 的水化液中被稀釋成準確濃度。但是，若在水化的同時上樣，IEF 膠條可負載相當大體積的樣品。最適水化溶液可根據蛋白質來源和經驗而靈活決定。