土壤的分子生物學特性

在我們的實驗室里，最難搞的樣品類型之一就是土壤。在開發提取土壤中微生物DNA、RNA的試劑盒和構思提取方法的過程中，我們需要收集記錄大量各種類型土壤的有機物含量、質地、pH以及采集地。這些因素與土壤微生物含量息息相關，同樣地也影響著提取DNA、RNA的得率。

下文，我將介紹一些影響土壤DNA、RNA提取的關鍵問題。

腐植酸(Humic substances）：

困擾提取土壤DNA和RNA的最大問題是其中的腐植質含量（腐植酸、黃腐酸等腐殖質）。腐植酸由有機物降解形成（植物、微生物等殘骸），并使得土壤呈黑顏色（苯醌基的分子結構）（1）。腐植酸分子都含有羧基和酚基，分子量大小不一。分子間抱團螯合成大分子多價陽離子，使得其非常利于微生物和植物的再次吸收利用（2）。有關腐植質更多詳細介紹，請點擊這里

因為腐植酸、黃腐酸與DNA、RNA一樣都是大分子親水性陰離子聚合物，很容易在最后步驟跟核酸一起被抽提出來。所以最好在最終洗脫核酸前把他們去除掉。

IRT技術（Inhibitor Removal Technology）：

抑制因子去除技術是MO BIO從土壤樣品中去除多苯多酚腐殖質的一項ZL技術。該技術的工作原理是通過改變pH值先溶解后沉淀蛋白等大分子物質。核酸在這個過程中不會被沉淀，從而分離去除掉抑制因子。該技術同樣適用于血液中的亞鐵血紅素和糞便樣品、皮膚中的黑色素、法醫樣品中染血衣服上的染料。

微生物細胞裂解（Lysis of microorganisms）:

去除抑制因子是困難的第一步，而裂解土壤中的微生物細胞則是第二步。否則沒法準確描述土壤微生物結構情況。機械裂解法可以快速有效地裂解土壤中的細菌和真菌。我們實驗室更喜歡用Vortex Genie 2 ，因為它有比強力高速珠磨研磨機所沒有的優勢。

宏基因組學（Doing metagenomics）?

使用渦旋儀(Vortex)最大的一個好處就是，它長達10分鐘相對輕柔的作用力破碎細胞可以得到更大分子量的DNA。低速轉動過程中產生很少的熱量，避免過多熱量積聚引起的DNA、RNA降解。配合使用MO BIO的裂解緩沖液，可以更大限度減少DNA、RNA的破損，保障核酸分子完整性。 裂解緩沖液也是IRT技術的一部分。宏基因組學要求大分子量DNA，故渦旋儀(Vortex)是最好的選擇。

節省經費？

渦旋儀體積小價格便宜，特別適合經費有限的實驗室，也特別適合在野外搭建臨時實驗室。渦旋儀重量輕，最多還能一次處理24個樣品。MO BIO 已經開發出一系列用在 Vortex Genie 2.上的適配器（Vortex adapters），適應各種大小的Tube管。

更強的裂解?

渦旋儀和我們的其它溶液足可以裂解絕大部分生物體，而對于一些真菌孢子類則需要更強力的裂解。對于這類樣品，我們建議在渦旋振蕩前加入加熱步驟。就是加樣后在65℃~70℃孵育10-15min（4,5）。另一個可選方法是渦旋振蕩前反復多次凍融。這些加強的裂解足可以對付堅硬的孢子、真菌細胞。

高速珠磨研磨機如何？

高速珠磨研磨機有時是對付堅硬生物體的有效手段，但過高的速度會過分剪切DNA，產生的熱量也會加速RNA的降解。在我們的實驗室里，通過凝膠電泳并沒有觀察到使用高速珠磨研磨機對DNA得率有所貢獻。反而Nanodrop 的分光光度計在260nm讀數偏高，意味著DNA破損嚴重。（核酸蛋白定量儀）。使用平板培養計數存活的細菌，發現使用渦旋儀和Precellys出來的結果差不多。不過高速珠磨研磨機Precellys增加了植物和昆蟲DNA的釋放，稀釋了微生物DNA所占的比例。實驗過程中應該盡量避免。

總結：

在后面的文章里，將詳細介紹土壤DNA的提取方法，以及在使用Powersoil DNA Kit和RNA Powersoil Kit時提高得率和純度建議和技巧。

參考文獻：

• A. Piccolo (2002). "The Supramolecular structure of humic substances. A novel understanding of humus chemistry and implications in soil science". Advances in Agronomy 75: 57–134.

• F.J. Stevenson (1994). Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. John Wiley & Sons, New York

• Techniques in Microbial Ecology, Burlage, Robert S., Ronald Atlas, David Stahl, Gill Geesey, and Gary Sayler, editors. 1998. Oxford University Press, New York, Page 277

• Development of Quantitative Real-Time PCR Assays for Detection and Quantification of Surrogate Biological Warfare Agents in Building Debris and LeachatePascal E. Saikaly, Morton A. Barlaz, and Francis L. de los Reyes IIIApplied and Environmental Microbiology, October 2007, p. 6557-6565, Vol. 73, No. 20

• Evaluation of five commercial nucleic acid extraction kits for their ability to inactivate Bacillus anthracis spores and comparison of DNA yields from spores and spiked environmental samplesLeslie A. Dauphin, Benjamin D. MoserJournal of Microbiological Methods, Volume 76, Issue 1, January 2009, Pages 30-37