土壤微生物DNA提純方法及純度檢測

實驗概要

本實驗比較了聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和交聯聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)在DNA提取過程中的純化作用，并利用低電壓長時間電泳法及PVP電泳法對純化的DNA樣品進行了檢測。

主要試劑

DNA提取緩沖液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na₃PO₄, 1.5 M NaCl, pH 8.0)

溶菌酶(50 mg/mL)

蛋白酶K(20 mg/mL)

10% SDS

RNAse 20 mg/mL

聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)

交聯聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)

TENP緩沖液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)

PBS(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na₂HPO₄, 2 mmol/L KH₂PO₄, pH 7.4)

NaOH溶液

10% HCl

TE緩沖液(pH 7.6)

氯仿

異戊醇

異丙醇

主要設備

高速離心機

PVPP離心柱

Sephadex離心柱

Sephadex G-200樹脂

3S DNA Purification Kit純化柱

電泳槽

電泳儀

2 mL、1.5 mL離心管

實驗材料

10 g土樣的粗DNA樣品

實驗步驟

1. 聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)和交聯聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)在DNA提取過程中的純化作用比較

   (1) 稱取0.1 g土樣，置于2 mL滅菌的離心管中，直接加入500 μL DNA提取緩沖液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na₃PO₄, 1.5 M NaCl, pH 8.0)，10 μL溶菌酶(50 mg/mL)，2.5 μL蛋白酶K(20 mg/mL)，37℃水浴30 min，加100 μL 10% SDS 65℃水浴1 h，8 000 r/min離心5 min，上清用等體積氯仿:異戊醇抽提后用0.6 倍體積異丙醇沉淀，30 μL ddH₂O(含RNAse 20 mg/mL)溶解；

   (2) 稱取0.1 g土樣加入0.1g PVPP，加入500 μL DNA提取緩沖液，其余同(1)；

   (3) 稱取0.1 g土樣加入0.1g PVP，加入500 μL DNA提取緩沖液，其余同(1)；

   (4) 稱取0.1 g土樣加入1 mL TENP緩沖液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)，渦旋混勻5 min，12 000 r/min離心1 min，棄上清，沉淀反復洗兩遍或至上清基本近無色，再用1 mL PBS(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na₂HPO₄, 2 mmol/L KH₂PO₄, pH 7.4)緩沖液洗一遍，然后再加入500 μL DNA提取緩沖液，其余同(1)；

   (5) 稱取0.1 g土樣加入1 mL TENPP緩沖液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVPP, pH 10.0)，其余同(4)。

0.8%瓊脂糖常壓電泳(150 V, 30 min)檢測。

2. 柱純化

   (1) PVPP離心柱：將1 g酸化PVPP(用10% HCl煮沸10分鐘，NaOH中和后再用水洗直至中性晾干即可)加入1 mL離心柱上，將離心柱放在1.5 mL離心管上，加入1 mL TE，10 000 r/min離心1 min，倒空離心管再重復離心一次脫干PVPP。將離心柱放在新的1.5 mL離心管上。將100 μL粗DNA在PVPP離心柱上，10 000 r/min離心1 min；

   (2) Sephadex離心柱：Sephadex G-200樹脂用TE緩沖液(pH 7.6)在4℃平衡過夜，將細碎的顆粒去除。在1 mL離心柱上加入500 μL平衡后的Sephadex G-200凝膠，3 000 r/min離心直至凝膠體積不再變化。加入100 μL粗體DNA樣，3 000 r/min離心1 min；

   (3) 結合Sephadex柱和PVPP柱：取100 μL粗DNA樣品，經PVPP柱10 000 r/min離心1 min，再經Sephadex柱3 000 r/min離心1 min；

   (4) 商品純化柱：使用3S DNA Purification Kit純化柱，將100 μL粗DNA以PCR產物方式按照說明進行純化，必要時使用BS緩沖液反復漂洗2~3次，30 μL ddH₂O回收。

0.8%瓊脂糖常壓電泳(150 V, 30 min)檢測。

3. 電泳法：

   (1) 低電壓長時間電泳法：1%瓊脂糖凝膠電泳在25 V進行4~8 h以上；

   (2) PVP電泳法：在1%瓊脂糖凝膠中加入2% PVP，25 V進行電泳4~8 h以上；

電泳結束后切下DNA主帶，用凝膠回收試劑盒進行膠回收。

0.8%瓊脂糖常壓電泳(150 V, 30 min)檢測。