土壤纖維素酶活性測定

一、原理 
　　
　　纖維素是植物殘體進入土壤的碳水化合物的重要組分之一。在纖維素酶作用下，它的初水解產物是纖維二糖，在纖二糖酶作用下，纖維二糖分解成葡萄糖。所以，纖維素酶是碳素循環中的一個重要的酶。纖維素酶解所生成的還原糖與 3,5- 二硝基水楊酸反應而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關，因而可用測定還原糖量來表示蔗糖酶的活性。 
　　
　　二、試劑 
　　
　　1）甲苯 
　　
　　2）1%羧甲基纖維素溶液：1g 羧甲基纖維素鈉，用50%的乙醇溶至100ml。 
　　
　　3）pH5.5醋酸鹽緩沖液： 
　　
　　0.2mol/L 醋酸溶液  11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L； 
　　
　　0.2mol/L 醋酸鈉溶液  16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L； 
　　
　　取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸鈉溶液混勻即成PH 5.5醋酸鹽緩沖液。 4）3,5-二硝基水楊酸溶液：稱1.25g二硝基水楊酸，溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中，再加75g酒石酸鉀鈉，用水稀釋至250ml（保存期不過7天）。 5）葡萄糖標準液（1mg/mL）  
　　
　　預先將分析純葡萄糖置80℃烘箱內約12小時。準確稱取50mg葡萄糖于燒杯中，用蒸餾水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，搖勻（冰箱中4℃保存期約一星期）。若該溶液發生混濁和出現絮狀物現象，則應棄之，重新配制。 
　　
　　三、操作步驟 
　　
　　葡萄糖標準曲線：分別吸1mg/mL的標準葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL于試管中，再補加蒸餾水至1mL，加DNS溶液3ml混勻，于沸騰水浴中加熱5min，取出立即泠水浴中冷卻至室溫，以空白管調零在波長540nm處比色，以OD值為縱坐標，以葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。 
　　
　　    稱10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，搖勻后放置15min，再加5ml 1%羧甲基纖維素溶液和5ml pH5.5醋酸鹽緩沖液，將三角瓶放在37℃恒溫箱中培養72h。培養結束后，過濾并取1ml濾液，然后按繪制標準曲線顯色法比色測定。（為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差，每一土樣需做無基質對照，整個試驗需做無土壤對照；如果樣品吸光值超過標曲的大值，則應該增加分取倍數或減少培養的土樣。）     
　　
　　四、結果計算 
　　
　　纖維素酶活性以72h，1g干土生成葡萄糖毫克數表示。 纖維素酶活性=（a樣品－a無土－a無基質）×n／m 
　　
　　其中：a樣品、a無土、a無機質分別表示其由標準曲線求的葡萄糖毫克數；n為分取倍數；m表示烘干土重。