基于微液滴可裂解的電離質譜成像表征功能生物大分子

　　近日，斯坦福大學化學系Richard N.Zare教授課題組在Angewandte Chemie上發表了題為“Immuno-Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Imaging Identifies Functional Macromolecules by Using Microdroplet-Cleavable Mass Tags”的研究論文。

　　解吸電噴霧電離質譜成像 (DESI-MSI) 是在常壓敞開式環境下，利用電噴霧液滴對生物組織成分軟電離，并將其引入質譜進行檢測與可視化的一種分析技術。自DESI-MSI技術發展至今，已廣泛應用于體內藥物分析、臨床分子診斷、空間代謝組學等生物醫藥研究領域，其可檢測分子主要涵蓋有機合成藥物、內源性代謝物和脂質等分子量低于1000的小分子化合物。

　　靶點研究是藥物研發的重中之重，包括在疾病發生發展進程中起關鍵調控作用的酶、受體、轉運體、離子通道等生物大分子。這些藥物靶點是參與信號通路及代謝通路調控等功能的重要執行者，且與藥物治療或毒副作用有直接關聯。闡明藥物干預下靶點及其信號通路分子在體內分布與變化，對預測候選藥物的分子靶向性、評價藥效與毒性、深入理解藥物作用分子機制等至關重要。然而由于上述功能生物大分子的超高分子量、低豐度和低電離效率，直接對組織樣本進行蛋白質成像目前仍然是對DESI-MSI的一大挑戰。

　　基于免疫識別與分子標簽的成像策略為DESI-MSI實現生物大分子的檢測提供了一種切實可行的思路。標簽分子及其裂解方式的設計是其中的核心技術問題。根據已知的微液滴化學研究報道，DESI在正模式高壓電下產生的微米級水相液滴，在其氣-液界面富含高濃度的質子，因此可以加速酸催化有機反應的進程。本研究設計合成了一系列苯硼酸類標簽分子，在堿性條件下，將其與抗體非識別區人工修飾側鏈上的半乳糖胺通過苯硼酸酯鍵共價結合。利用酸性電噴霧溶劑可在微秒時間內快速將苯硼酸酯鍵斷裂的特性，實現了標簽分子的在線原位釋放，使得DESI-MSI 在單張組織切片上定位多個不同的功能生物大分子成為可能，實現了基于DESI質譜成像的多重免疫組化檢測，本研究將這種方法被命名為“immuno-DESI-MSI”。

　　苯硼酸類標簽分子硼元素的引入，不僅實現了pH調控的可逆結合/釋放，還使標簽分子離子在質譜中具有可辨識的獨特同位素分布模式(M+1基峰)。標簽分子含有叔胺及季胺基團，因此具有極高的解吸電離效率，此外，標簽分子中具有高度共軛的剛性平面結構，因此具有熒光發射特性，使得合成的標簽分子-抗體探針，具有組織微區域可分辨的質譜成像和細胞分辨的熒光顯微成像雙重功能。通過常規DESI-MSI與immuno-DESI-MSI圖像配準，即可關聯藥物、靶點、信號通路、酶以及下游代謝通路多個層次的空間關聯信息。作為概念驗證，本研究最后選取拉帕替尼為受試藥物，探究了其對于藥物靶點EGFR及其信號通路相關分子的抑制作用以及下游代謝層面的影響。

圖1. 設計的標簽分子及探針結構和immuno-DESI-MSI的一般工作流程

圖 2. 免疫熒光顯微鏡成像 和 immuno-DESI-MSI 的交叉驗證

圖3. EGFR通路中6個大分子的immuno-DESI-MSI圖像及其與抗EGFR藥物拉帕替尼的空間相關性分析

圖 4. 由immuno-DESI-MSI 獲得的藥物、靶點、信號通路和代謝組信息用于藥物作用分子機制分析

　　作者簡介

　　本研究的通訊作者為斯坦福大學化學系理查德·杰爾(Richard N.Zare)教授，國際知名物理化學和分析化學家，中國科學院外籍院士，美國國家科學院院士，美國藝術與科學院院士，英國皇家學會外籍院士，歐洲科學院院士，瑞典皇家工程科學院外籍院士，發展中國家科學院院士。主要研究方向包括激光化學、微液滴化學、質譜分析等，目前重點聚焦于微液滴化學的理化性質與基礎理論研究，以及微液滴在材料、合成、催化、生物醫學診斷等領域的應用。

　　本研究的第一作者宋肖煒，2017年畢業于中國醫學科學院/北京協和醫學院藥物研究所，師從再帕爾教授，獲藥物分析學博士學位，研究方向為定量質譜成像分析方法及其在藥物研發中的應用。2017年9月-2022年6月在復旦大學化學流動站開展博士后工作，期間于2020年1月起在斯坦福大學交流訪問和繼續博士后工作，主要方向為微液滴化學與常壓原位電離質譜分析新方法研究。在PNAS、J. Am. Chem. Soc.、Angewandte、Anal. Chem.、EBiomedicine等綜合性期刊、化學、分析化學、質譜分析或生物醫學類期刊以第一作者及通訊作者發表論文18篇，申請國家ZL6項，主持國家自然科學基金青年基金項目1項、中國博士后基金面上項目1項。

　　原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202216969