摘要 數字PCR是一項針對單分子目標DNA的絕對定量技術。該技術是將含有DNA模板的反應溶液分配到大量獨立的反應室中并且發生擴增反應，通過統計反應室中的陽性信號來定量DNA的拷貝數。DNA樣品在反應室中隨機和獨立分布是單分子成功擴增和準確定量D
NA拷貝數的關鍵因素。本文綜述了數字PCR的發展歷史、數字PCR與實時熒光定量P
CR的區別，以及數字PCR在臨床診斷、轉基因成分定量、單細胞基因表達、環境微生物檢測和下一代測序等方面的最新進展，并展望了該技術的應用前景
關鍵詞 數字PCR，絕對定量，實時熒光定量PCR，拷貝數，單分子。
核酸的序列、多樣性和豐度分析是現代生物學的基礎。核酸定量技術在診斷和個體化醫療、食品檢驗和轉基因生物檢測、病原體鑒定、法醫科學等方面已被廣泛應用，同時這些應用也推動了核酸定量技術的進步。
DNA分子擴增技術的應用促進了分子生物學技術的發展[2]。精確定量 DNA
拷貝數是現代分子生物學和醫學的重要應用之一。數字PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)作為
DNA 定量的新技術，克服了實時熒光定量PCR (real timequantitative PCR，qPCR)的一系列缺點，實現了單分子
DNA 絕對定量。dPCR是將單個 DNA 樣品反應液分別進行數以百計的反應，并且每個反應分別進行擴增檢測。dPCR是 DNA
絕對定量方法，解決了qPCR 所用的標準曲線對測量結果產生影響等問題，并可減少 qPCR
帶來的基體效應。此技術在臨床診斷、轉基因成分定量、單細胞基因表達、環境微生物檢測和下一代測序等方面的研究發揮了重要作用。
1 dPCR技術發展歷史
1992年，Sykes
等報道了基于樣品稀釋和泊松分布數據處理的巢式PCR定量技術，并提出了數字PCR的構想。1997年，Kalinina
等使用玻璃毛細管進行了微升(μl) 級的PCR反應，通過熒光探針收集到基因組DNA的單分子信號，進而發展了單分子定量技術。1999年,
Vogelstein 和Kinzler基于以上報道采用96孔板系統發展了微升級的PCR擴增方法，用于結腸癌的致癌突變基因ras
的定量分析。隨之，Dressman 等發明了一種BEAMing方法(
珠子、乳劑、擴增與磁力)：將鏈霉親和素與磁珠共價結合，磁珠外包裹一層生物素的PCR引物，進行擴增反應。反乳化作用后，使用流式細胞儀通過磁珠分析等位基因變異。盡管步驟較多，該技術仍不失為廣泛應用于實驗室定量DNA的理想方法，可以用來檢測和定量單核苷酸多態性(single
nucleotide polymorphism，SNP)
或突變等核酸序列變異及含有變異等位基因的磁珠能夠被流體分離排序，因而可應用于樣品測序等序列分析。
盡管dPCR技術具備廣闊應用前景，但由于96孔或384 孔平板加樣的復雜操作為精確測量帶來了困難，也難以解決高通量測量問題。微流體的出現和納升(nl) 反應儀器的開發克服了這些技術的瓶頸。在2003年，Liu等使用微流體的概念，在微流體芯片上進行了400 個獨立的3nl PCR反應。2008 年，嵌入式芯片的PCR 反應次數達到了9180 個6nl 的PCR平行反應。例如，Fluidigm公司的Biomark 系統，此系統微流體dPCR芯片由12個獨立的微流體面板(panel) 和相應進樣孔組成(圖1). 每個面板含有765 個6nl 的獨立反應室(partition)。4.6μl反應液通過進樣孔進入后被分配到765個反應室進行獨立擴增。該技術在日趨完善的同時，單次的反應數和檢測精度成為此項技術研究的重點。最近，Heyries 等報道了一個百萬級的微流體dPCR裝置，成為了dPCR技術的又一重大突破。該裝置通過表面張力以達到樣品分布和疏水控制，提高了單分子DNA擴增的保真性，每皮升( pl) 進行100萬個反應，達到每平方厘米(cm2) 44萬個反應。這種裝置可實現每10萬個野生型序列中低于一個變異拷貝的檢測。
圖1 微流體dPCR的12×765 反應芯片