這一章描述的實驗方法是基于我們關于來自S N V 及其緊密相連的R E V -A 載體的實 驗 （P a r v e
e n e t a L 2000)。我們曾用這兩種病毒載體對各種細胞進行基因轉移，包括初期的造血細胞、人腦及有絲分裂后的神經元細胞（Parveen etal.2000)。與其他反轉錄病毒載體相同，基 于 S N V 載體系統的三個主要元件是：①包裝信號序列（恥 ，以確保載體R N A 殼體化進入反轉錄微粒；②反轉錄機制；③整合前病毒載體進人宿主細胞的必需序列（Kurian etal.2000; D o r n b u r g 2003)。為了加強病毒微粒的治療潛能，病毒的生命周期被遺傳改造，即這些微粒在
| 實驗步驟 | 基 于 S N V 載體體系的反轉錄病毒的生成以及它們在各種細胞類型轉導中的應用材料試劑 氯 化 鈣（CaCl2) (2mol/L) 溶 解 14. 7 g CaCl2 于 IOOml H2O 中。過濾除菌或高壓滅菌。 轉染的細胞系： 293T 和 D17 (ATCC) 甘 油（1 0 % ?2 0 % ) (合適的） H ank 平衡鹽溶液（HBSS) 2 X H E P E 緩 沖 液（HBS: 280m m ol/LN aCl、 1 0 m m o l/L K C l 、 1.5Imnol/LNa2 H P 0 4< ! > 、 12m m ol/L 葡萄糖、 50m m ol/LH EPES， pH 7.5) LacZ 染 色 試 劑（Chemicon) 培養基 完全培養基： D M E M 培養基含 1 0 % 胎牛血清 F C S (293T 細胞）或 F B S (D 17細胞）、 1 % 青-I S 霉素、 1 % 谷氨酸 無血清培養基，含 1 % 青鏈霉素、 1 % 谷氨酸 磷酸鹽緩沖液（P B S ) (合適的,?若操作甘油休克則需要） 無核酸酶水 用于生成反轉錄病毒的質粒 編碼病毒包被蛋白的質粒 含有目的基因的基因轉移載體 編碼 E n v 蛋白的質粒 基于 SNV 和 REV-A 的病毒被表達特異性針對人類細胞表面受體的靶向配體的 VSV-G或其他 Env 包被蛋白假型。用作轉染的質粒 DNA 的質量對于生成高滴度的反轉錄病毒載體是至關重要的。它應該是超純的，應避免任何化學污染物， RNA 或蛋白質。我們建議用于反轉錄病毒顆粒生成的純化的 DNA 的 A2m :A28。值大于 1. 8。 聚凝胺 Transfenctam 試 劑（P r o m e g a ) (合適的） 儀器 細胞培養皿 [ I O O m m (或采用利于多次轉染的 12 孔 或 2 4 孔板）和 6 孔板] 離 心 管（15m l ) 濾器：乙酸或聚磺酸纖維素（結合小分子蛋白質）， 〇.45um 濾膜 孵箱，預設到 37°C 小 離 心 管（1.5m l ，滅菌的） 顯微鏡 移 液 管（1.0m l 或巴斯德吸管） 搖床 超速離心機（B e c k m a n )， S W 41 轉頭 方法 細胞的準備 1.轉染前 24 h，用完全培養基種植 293T 或 D 17 細胞在 IOOmm 平板中，過夜生長。種植 密 度 決 定 于 細 胞 的 增 殖 能 力 。一 般 來 說 ， IOOmm 的 平 板 種 植 0.5 X IO6 ?0.8X 106。 2.觀察細胞密度， ‘匯合度應為 7 5 % ?8 0 % 。用 I O m l 新鮮的完全培養基替換原培養基。孵 育 4 —— 6 h 。 細胞匯合度在獲得最佳的病毒滴度中起主要作用。 轉染 此方法適用于 IOOmm 細胞培養板。 D N A 的轉染量應隨著用于轉染的培養板的大 3.對每個 I O O m m 平板，向已滅菌的 I.5m l 小離心管中加人 0 ?5m l 2 X H E P E S 緩沖液，標記為管 1。 對于多個轉染，用 12 或 2 4 孔板來準備轉染混合物更簡單。 4.另一管標記為管 2 , 加 人 IOug G a g -P o l 包被質粒， 4? 5 啤 E nv ( V S V G 或 S N V 野生型）包被質粒和 1 〇鴻轉染載體。質粒 D N A 的總量不應超過 30 ug 。 加 人 62ul 2m ol/LCaCl2 和足量的無核酸酶水，使總體積達到〇 . 5 m l。 5 . 用 I. O m l 移液管或巴斯德吸管將管 2 中的混合物逐滴加人管 1 中并用力吸打。或者在加人管 2 的過程中振蕩管 1。最終溶液將生成沉淀，沉淀呈乳白色。 7.用吸液管上下吹打或振蕩使沉淀混合均勻。 8 . 加 I m l 懸液和 5m l 無血清培養基到含 2 9 3 T 或 D 1 7 細胞的平板中。逐滴緩慢地加人混合懸液并輕柔漩渦。 9.37°C 孵 育 4?6 h 。用 含 l 〇%F C S 的新鮮培養基替換原培養基。孵 育 36?40 h 使產生重組病毒。 甘 油 休 克（合適的） 一些實驗室在這一步進行甘油休克，以增加細胞核對導人 D N A 的吸收。在我們基 10?若選擇甘油休克，則如下操作： a?吸去培養基，用 5 ml PB S 或培養基洗兩次。在清洗過程中搖晃平板并在顯微鏡 b. 加 入 2m l 已確定濃度的甘油到細胞中， 2?4 min。 c?棄去甘油， PB S 清洗，加 IO m l 新鮮培養基。 反轉錄病毒載體上清的收集 11.對于基于 SN V 載體生成的病毒，在 更 換 培 養 基 36?4 0 h 后 ，收 集 轉 染 的 293T 或D 17 細胞的上清液。將 其 至 于 15mi 離 心 管 中 ， 1500r/m in 離 心 5 min，棄去細胞碎片。 12?轉移上清。立即用于滴度測定或_ 8 0 °C 冷凍直至需要用于轉染。對 于 基 于 S N V 和R E V - A 的載體系統而言，用生物學滴度來衡量病毒的產量。上清要注意避免多次凍融，因為這樣會導致反轉錄病毒滴度的嚴重減少。 反轉錄病毒微粒的濃縮 13.通 過 〇.45um 的濾膜過濾反轉錄病毒載體上清液。 不要用消化纖維濾膜，因為蛋白質會與濾膜結合，從而毀壞病毒膜表面。 14.H Bekman 超速離心機 SW4 轉頭 ， 4℃ ， 25 000r/m in 離 心 2 h 上清液。 15.緩慢地棄去上清，不攪動沉淀。用 50f J H B S S 重懸含反轉錄病毒微粒的沉淀。 16?確定濃縮的反轉錄病毒的滴度，詳見下部分所描述，或一 80-C 凍存至下次應用。 由于凍融明顯的減少滴度，特別是對 S N V , 所以最好現用現制。 確定反轉錄病毒的轉導效率 此 流 程 需 要 或 其 他 報 道 基 因 整 合 到 轉 移 載 體 中 。 17?確定反轉錄病毒滴度方法如下： 對于貼壁細胞 b . 棄去培養基，加 I m l 病 毒 載 體 上 清 液 ，其 中 包 含 反 轉 錄 病 毒 微 粒 和 濃 度 為lO ug/m l 的聚凝胺。 或者，使用 Transfectam 試劑，濃度為 2ug/ml。 據觀察， Transfectam 試劑比聚凝胺毒性小。 c. 3?5 h 后（根據細胞類型），用 I O m l 新鮮培養基替換含有病毒的培養基。繼續培養細胞 48 h 。 d. 若有 諸 如 報 道 基 因 的 存 在 ，則 由 IacZ 試劑染色并計數藍色細胞，從而以克隆形成單位（cfu) /m l 表示滴度。 若采用的是其他報道基因，則 可 采 取 免 疫 細 胞 化 學 或 實 時 聚 合 酶 鏈 反 應（PCR) 的方法，來精確檢測基因表達和病毒滴度。 對 于 非 貼 壁 細 胞 的 轉 導（懸 浮 細 胞） a?轉染前于 6 孔板中種植靶細胞 12?18 h , 密度為 1.5X 106 個/m l 培養基。 b. 離心懸液中的細胞。在 聚 凝 胺（8ug/m l ) 或 Transfectam (2ug/m l ) 存在的情況下，在 病 毒 載 體 懸 液 中 以 1.5X 106 個/m l 的密度重懸細胞。如 前 所 述 ，T r a n s f e c t a m 由于毒性較小，是較好的選擇。 c. 若采用聚凝胺作為轉染試劑，則觀察它對于細胞增殖和生長的作用是必需的， d. 4?5 h 后離心棄去病毒微粒，完全培養基孵育 48 h ，如貼壁細胞所述。 e. 為了進一步增加效率，起始轉染 12?24 h 后可進行多次轉染。 f. 固定并計數轉染的細胞，確 定 cfu/m l 。 采 用 基 于 S N V 的反轉錄病毒微粒轉導有絲分裂后的神經元細胞 此方法用于轉移 Z a c Z 報道基因到有絲分裂后的分化的神經元細胞。 a. 根據先前由 M u k h t a r 等所描述的程序準備有絲分裂后的分化的神經元細胞。 b. 用 反 轉 錄 病 毒 微 粒 懸 液 和 T r a n s f e c t a m 試 劑（2ug/m l ) 混合覆蓋細胞。放置 2 h 。 c. 重復反轉錄病毒微粒覆蓋程序 3 次，間隔 24 h d. 通過互補技術，確定這些有絲分裂后細胞中報道基因或治療基因的表達。 |
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