基于色譜質譜聯用技術檢測尿液中類固醇激素及代謝物的研究進展

　　摘 要

　　類固醇激素在人體新陳代謝、免疫調節、生長發育、維持生命功能等方面具有重要作用，但其同時又作為一類新型有機污染物，干擾人體正常的內分泌機能從而對人體產生危害，因此類固醇激素的研究已逐漸成為國際上環境和健康領域的研究熱點。尿液具有無創收集、前處理簡單、能敏感地反映生理變化等優勢，更適用于定期、重復監測。

　　色譜-質譜聯用技術靈敏度高、選擇性好、通量高，在尿液類固醇激素檢測中得到了廣泛應用。

　　本文基于色譜-質譜聯用技術綜述了檢測類固醇激素的尿樣的采集和儲存條件、前處理技術、色譜-質譜分析方法、分析軟件和數據庫，以及部分類固醇激素在我國不同健康人群尿液中的檢出情況等研究進展，指出尿液中類固醇激素及其代謝物的檢測因基質復雜、種類繁多以及含量較低，仍需進行廣泛而深入的研究，實現對多種類固醇激素及其代謝物的精確定量仍面臨挑戰。

　　未來研究需建立標準化采集和儲存方法，開發更高效和環境友好型的前處理技術以及高靈敏度、高可靠性和高通量的色譜-質譜儀器，合成更多類固醇激素及代謝物標準品和同位素，同時不斷完善數據庫信息以滿足精確定量的需求，為尿液中類固醇激素檢測及人群健康風險評估等研究提供參考。

　　類固醇激素，又稱甾體激素，是一種親脂性小分子化合物，種類繁多，根據結合的受體可分為兩大類：性激素(包括雌激素、雄激素和孕激素)和皮質激素(包括糖皮質激素和鹽皮質激素)。按照來源可分為內源性和外源性類固醇激素，其中，內源性類固醇激素是由機體的分泌器官或組織自然合成，用于維持機體內穩態平衡；外源性類固醇激素由人工合成或其他生物體排泄而來，屬于內分泌干擾化合物(Endocrine Disrupting Chemicals, EDCs)。類固醇激素在人體新陳代謝、免疫調節、生長發育、維持生命功能等方面具有重要作用，即使少量激素都會對人體產生較大影響。當人類長期接觸或攝入環境及食品中含有激素殘留的物質時，超過某一限定值時將會對人體產生負反饋作用，從而破壞機體的正常生理平衡，致使激素分泌失調進而對人體健康造成威脅。歐盟自1996年起禁止畜牧業使用促生長激素，并將雌激素列為優先檢測的118種內分泌干擾物之一。同時，英國制定了環境質量標準，以限制雌激素的排放。我國2019年頒布農業農村部公告第250號，禁止在食品動物中應用合成類固醇激素。因此，類固醇激素的暴露評估已成為環境健康領域的研究熱點之一。

　　多數類固醇激素經過I期和II期代謝后，以葡萄糖醛酸和硫酸鹽的形式通過尿液排出。研究表明，與血清檢測相比，尿液類固醇激素檢測具有更好的敏感性和特異性，更適用于定期、重復監測；此外，尿樣一般不需要復雜的衍生化處理，前處理方法較血樣更為簡單，而且采集方法非侵入性，操作方便，受試者易于接受。因此，選擇尿液進行類固醇激素及其代謝物定量分析具有一定優勢，已在類固醇激素內暴露水平檢測中得到廣泛應用。尿液中常見的類固醇激素基本情況、代謝物以及類固醇激素紊亂帶來的相關疾病如表1所示。

　　早期類固醇激素的測定主要通過免疫學技術，但這種技術往往需要大樣本量，耗時耗力，且檢測結果易受到抗體之間交叉反應的干擾，降低了結果的可靠性，僅適用于進行單一或少數幾種物質的分析。隨著儀器技術的不斷進步，色譜-質譜分析方法，如氣相色譜(Gas Chromatography, GC)、液相色譜(Liquid Chromatography, LC)、高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)和超高液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC)等色譜技術與三重四級桿(Triple Quadrupole, QqQ)、四極桿-離子阱(Quadrupole Trap, Q-Trap)、飛行時間(Time of Flight, ToF)、靜電軌道阱(Orbitrap)和四級桿-飛行時間(Quadrupole-Time of Flight, Q-ToF)等質譜(Mass Spectrometry, MS)技術聯用，已實現了高通量和高精度的分析，廣泛應用于尿液類固醇激素檢測。

　　由于尿液中類固醇激素含量普遍較低，介于pg/L~ng/L之間，亟需建立高回收率的前處理技術以及高靈敏度、特異度的色譜-質譜分析方法，進而開展靶向和非靶向分析。本文綜述了用于檢測類固醇激素的尿樣的采集和儲存條件、尿液中類固醇激素的前處理技術、色譜-質譜分析方法、分析軟件和數據庫，以及不同人群尿液中類固醇激素含量等，以期為尿液類固醇激素檢測及人群健康風險評估等研究提供參考。

　　1 尿樣的采集和存儲

　　由于下丘腦-垂體-腎上腺神經內分泌軸的調節，許多類固醇激素的濃度會發生晝夜波動。例如，CRL水平在午夜最低，在08:30達到峰值。因此，需要采集24 h尿樣以獲得平均且可比的數值。Bileck等通過GC-MS檢測對比了健康志愿者24 h尿樣和隨機尿樣中的40種類固醇代謝物，發現隨機尿樣不能代替24 h尿樣測定多種游離糖皮質激素。在實踐中尿液采集受多種因素影響，很難獲得24 h尿樣，有研究表明，晨尿也可用于類固醇激素檢測。

　　尿樣中基質復雜，存在多種微生物。微生物污染會誘導氧化還原反應造成類固醇激素降解，從而影響對尿液類固醇激素的正確評估。Kesner等研究表明：尿樣中的E3和PD代謝物在4 °C儲存2周保持穩定，但在儲存6個月后完全喪失其活性；PD代謝物在25和37 °C儲存時穩定性幾乎不變，但E3代謝物的穩定性顯著降低。故根據目標物選擇合適的條件才能確保尿樣采集和存儲過程中濃度不發生改變，但目前仍缺乏相關標準化程序。

　　2 尿樣前處理技術

　　2.1水解

　　類固醇激素在尿液中多以葡萄糖醛酸或硫酸鹽結合物的形式存在，在提取目標物之前需要使用酸、堿或酶對尿樣進行水解。Lee等使用酸水解后提取類固醇激素，部分代謝物未能被檢測到，表明該方法敏感性差且解離不完全。因此，目前研究主要通過β-葡萄糖醛酸酶或β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酶等水解酶進行酶解。在酶解過程中，需根據目標物在尿液中的存在形態確定適當的酶解參數，如酶的種類、溫浴時間和溫度、pH等。隨著檢測技術靈敏度不斷的提高，也可實現對代謝物的直接檢測。Van der Berg等在未經酶解的情況下，利用內標法直接定量尿液中的27種雌激素及代謝物，提供了完整的代謝產物圖譜。該方法靈敏度高，可探索類固醇激素的生物轉化途徑，還能減少酶解過程中對目標物的損失，但未來需要合成更多的代謝物及其同位素標準品以精確定量。

　　2.2萃取技術

　　由于尿樣的基質效應較高，且類固醇激素的濃度較低(ng/L)，故凈化、提取和濃縮等前處理步驟不可或缺。目前，尿液類固醇激素的萃取技術主要包括液-液萃取(Liquid-Liquid Extraction, LLE)、液相微萃取(Liquid Phase Microextraction, LPME)、固相萃取(Solid-Phase Extraction, SPE)和固相微萃取(Solid-Phase Microextraction, SPME)以及其他新型萃取技術，常見的萃取技術應用見表2。

　　2.2.1 液-液萃取

　　LLE是利用樣品各組分在不同溶劑中分配系數或溶解度存在差異的原理，從而實現純化待測物和去除干擾物的目的，主要受萃取劑的種類、用量以及尿樣pH等因素的影響。由于各種類固醇激素的極性不同，因此選擇合適的萃取劑至關重要。Hauser等在提取尿液中23種類固醇激素及其代謝物的實驗中，通過對比乙醚和甲基叔丁基醚的提取效果，發現甲基叔丁基醚對α-CRL提取的回收率比乙醚高24%。此外，尿樣pH對LLE的萃取效率亦有顯著影響。例如，Pozo等在提取人尿中類固醇激素代謝物時，對比了不同pH樣品的回收率，發現pH>2時，回收率低于50%，而pH=1時，回收率均大于80%。LLE成本低、選擇性高、能夠在降低基質效應的同時濃縮分析物，因此被廣泛應用于尿液類固醇激素研究領域，但其工藝復雜，需要手動操作，難以實現自動化。

　　2.2.2 液相微萃取

　　LPME指用極少量的溶劑提取液體樣品中目標化合物的技術，主要包括分散液-液微萃取(Dispersive Liquid-Liquid Microextraction, DLLEM)和中空纖維液相微萃取(Hollow Fiber Based Liquid-Phase Micro-extraction, HF-LPME)等。DLLEM是將萃取劑和分散劑混合注入樣品中，在分散劑的作用下實現對目標物質的有效萃取。Merib等基于DLLEM，優化了分散劑、萃取劑、提取時間等因素，選擇磁性離子液體作為萃取劑、甲醇作為分散劑，成功萃取了尿液中的E3、β-E2、α-E2和E1。HF-LPME是將萃取劑固定在多孔的中空纖維中，基于“分離相-萃取劑-固定相”的三液相體系從而對目標物進行萃取。Khataei等采用HF-LPME技術，通過優化萃取劑、鹽效應、纖維長度等因素，定量了尿液中CPA。LPME兼具操作簡單，靈敏度和精密度較高，易實現自動化，通量高和環保等優點，但該方法穩定性差且萃取劑毒性較大。

　　2.2.3固相萃取

　　SPE利用固體吸附劑來吸附樣品中目標化合物，以實現樣品基質和目標化合物的有效分離，從而達到分離和富集的目的，一般流程包括預洗、活化、平衡、上樣、淋洗、洗脫等步驟，主要受到吸附劑、洗脫溶劑和次數、pH等因素的影響。Van der Berg等比較分析了4種SPE柱，發現500 mg C18柱對對尿液中27種雌激素及代謝物的萃取率高，檢測限(Limit of Detection, LOD)和定量限(Limit of Quantitation, LOQ)均低于1 ng/mL；Son等用HLB柱萃取尿液中39種類固醇激素，通過對比洗脫溶劑(60%~100%甲醇) 發現， 100%甲醇的回收率最高；B?czek等用HLB柱提取尿液5種類固醇激素，發現在洗脫劑pH接近7時，提取效率最佳且吸附劑和分析劑之間不會相互干擾。SPE可選擇性地富集目標物以減少基質干擾和提高檢測靈敏度，并且可實現自動化處理。但是，某些化合物因共吸附和競爭吸附等因素的影響，具有較低的富集效率和回收率。此外，尿液基質中的干擾物需額外的預處理步驟，會增加前處理時間。

　　2.2.4固相微萃取

　　SPME是以石英纖維或其他材料為載體，在其表面涂覆不同性質的固定相，通過直接或頂空方式進行提和富集的技術，受涂層、溶劑、pH等因素影響，包括纖維固相微萃取(Fiber Solid-Phase Microextraction, Fiber SPME)、薄膜微萃取(Thin Film Solid-Phase Microextraction, TF-SPME)、管內固相微萃取(In-Tube Solid-Phase Microextraction, IT SPE)等。Qiu等以石英纖維為Fiber SPME載體，以分子印跡聚合物為涂層，優化影響因素后成功提取并定量尿液中的4種雄激素。TF-SPME是將吸附相涂覆在碳網片上的SPME技術，Turazzi等以聚苯胺-二氧化硅為萃取薄膜，優化了各種因素，成功定量尿液中的3種雌激素。IT SPE則利用開放式毛細管柱作為萃取裝置實現在線分析及微量濃縮，Saito等使用IT SPE裝置成功提取并定量尿液中7種外源性類固醇激素。與其他方法相比，這種技術具有高靈敏度和成本效益、簡單快速、環境友好等優點，但該方法使用的涂層昂貴，萃取頭損耗大，萃取容量易飽和。

　　2.2.5其他

　　除上述常用方法外，還有其他新型萃取技術可應用于尿液類固醇激素。例如，在線固相萃取(On-line SPE)是一種基于二維液相色譜的樣品前處理技術，Gaudl等通過在線固相萃取分析定量了尿液中18種類固醇激素，這種方法具有萃取柱可重復使用、直接進樣、高通量等優點，但比較復雜、適用范圍有限。攪拌棒吸附萃取(Stir Bar Sorptive Extraction, SBSE)是將活性攪拌棒置于樣品瓶中進行萃取后取出、洗凈，這種技術具有更高的萃取效率，但檢測時間較長、成本高且適用范圍受限，Huang等通過SBSE成功提取分析尿液中6種類固醇激素。蛋白質沉淀法(Protein Precipitation, PP)是通過添加有機溶劑、無機鹽或酸性物質來實現樣品中蛋白質沉淀的一種前處理方法，Wang等經乙腈與硫酸鋅(二者體積比為4:1)沉淀后，再過SPE柱凈化，檢測了尿液中15種類固醇激素及代謝物，這種技術操作簡便、損失較少，但方式較為粗糙、可靠性較低，通常需要與其他前處理方法聯用。

　　如今，色譜-質譜技術的應用提高了檢測的靈敏度，LLE、LPME、SPE、SPME等高效的前處理技術進一步縮短分析時間，還能最大程度上消除基質干擾，提高分析的準確性和可靠性，已經逐步取代傳統的前處理技術。前處理過程中影響萃取效果的因素眾多，未來應不斷優化實驗條件向自動化、高通量、低溶劑使用量以及環境友好的方向發展。

　　3 色譜-質譜分析檢測技術

　　色譜-質譜技術的LOD通常低于4 pg/mL，支持多目標物分析，可以提供全面的尿液類固醇激素信息，且由于不受抗體交叉反應的干擾，檢測結果更為可靠。根據研究目的和選用的檢測儀器的不同，尿液中類固醇激素及其代謝物的色譜-質譜分析檢測技術主要包括靶向分析和非靶向分析2種。

　　3.1 靶向分析

　　靶向分析技術是指依賴于在采集樣品數據之前獲取的目標化合物信息，使用QqQ和Q-Trap等質譜儀器，采用多重反應監測(Multi-Reaction Monitoring, MRM)或選擇反應監測(Selective Reaction Monitoring, SRM)模式，針對已知的類固醇激素物質進行靶向分析，被稱為代謝物定量的“金標準”。靶向分析技術根據標準品或數據庫獲得目標化合物的質譜和色譜等信息，從而篩選出目標物并進行定量檢測。目前，靶向分析是國內外尿液類固醇激素檢測的常用技術如表3所示。Wang等通過檢索數據庫及文獻信息選定15種重要的類固醇代謝物，使用靶向LC-MS/MS的MRM獲取其保留時間、離子對及離子比率等質譜信息，這種方法已成功定量并對比了不同年齡兒童尿液中目標物，且經過了美國食品藥品監督管理局、歐盟歐洲藥品監督管理局的生物分析評估的驗證。這種靶向分析技術具有高靈敏度、高特異性等特點，但僅對于已有標準品或數據庫信息的物質才可以精確定量，由于類固醇激素及代謝物種類繁多，缺乏規范的標準品，不能滿足當前靶向分析的研究需求。

　　3.2 非靶向分析

　　非靶向分析是指利用色譜-質譜技術分析鑒別樣品中的疑似或未知物，通常與ToF、Orbitrap和Q-ToF等高分辨質譜串聯，采用全掃描模式進行識別的技術。靶向分析不能滿足當前對更多類固醇激素及其代謝物研究的需求，因此需要通過非靶向分析以更全面的篩查和表征(見表4)。Wu等在無標準品的情況下，通過GC-MS對尿樣進行檢測，將所得的質譜數據與自建的類固醇質譜庫、商業國家標準以及已有研究中的質譜數據進行比較，創建可疑物列表，在全掃描模式下采集23種雄激素、15種皮質醇激素、19種雌激素和14種孕激素的數據；Liu等采用超高效液相色譜-四極桿-高分辨率質譜(UPLC-QE Plus-HRMS)和超高效液相色譜-三重四極桿質譜(UPLC-QqQ-MS)，通過全掃描和并行反應監測(Parallel Reaction Monitoring, PRM)模式對運動員尿中的違禁物質進行非靶向篩查，成功鑒定出26種糖皮質激素和3種性激素，其結果符合世界反興奮劑機構規定的最低要求。理想情況下，這種技術所監測的目標化合物數量不受限制，但由于不使用標準品，實際應用中無法對化合物進行絕對定量，且易受基質效應影響導致對代謝物的錯誤識別。

　　4 分析軟件和數據庫

　　尿樣經過質譜分析檢測后，可以獲得多種物質的離子信息，需要借助Mass Hunter、Trace Finder、MassLynx等不同分析軟件和生物信息學工具實現類固醇激素的峰分離。Struck等使用Mass Hunter分析尿液中的類固醇激素數據；Preindl等利用Trace Finder對雌激素數據進行分析。為了更好地利用尿液類固醇激素數據表征環境化學物質，研究人員已開發了多個含有質譜信息的數據庫，如METLIN數據庫、T3DB數據庫(Toxin Exposome Database)、HSDB數據庫(Hazardous Substances Data Bank, HSDB)等(見表5)。METLIN數據庫中包含了多種代謝物的質譜譜圖，經過XCMS在線數據平臺處理，有助于識別外源性類固醇激素的代謝產物及其毒理學效應；T3DB數據庫包含上千種毒物及質譜信息，詳細描述了人體尿液中毒物的毒性濃度、作用機制和靶點等。這些數據庫為研究類固醇激素提供了重要的資源和工具，可用于識別外源性類固醇激素和其尿液代謝物，但由于種類繁多，現有數據庫信息仍不能完全滿足研究需求。

　　5 部分類固醇激素在我國不同健康人群尿液中的檢出情況

　　近年來，利用色譜-質譜聯用技術檢測尿液中的類固醇激素濃度的相關研究已經廣泛展開。部分類固醇激素在我國不同健康人群尿液中的檢出情況如表6所示。高照等采用GC-MS檢測廣東省1 474名運動員尿液中主要的內源性類固醇激素含量，發現尿液TTR濃度為1.48~14.71 ng/mL，ADR濃度為1145.8~1940.16 ng/mL，Epi-TTR濃度為9.55~36.03 ng/mL；Wang等采用LC-MS/MS檢測0-20歲的兒童和青少年尿液中4種激素濃度，發現α-E2、TTR、ADR、DHEA濃度分別為0~29.2、0~144.7、0~1 061、0~11 890.5 ng/mL。

　　6 總結和展望

　　類固醇激素在人體內微量存在，但扮演著調控生命機能的關鍵角色，是維持生理平衡的重要物質。而長期接觸或攝入環境或食品中含有激素殘留的物質時，又會對人類健康產生不良影響。在評估類固醇激素暴露對機體帶來的影響時，尿樣能更敏感地反映生理變化等因素，相較于其他生物樣本，顯示出獨特的分析優勢。

　　當前，尿液前處理技術已經十分成熟，可根據目標激素的理化性質，選擇合適的水解及萃取技術，以更準確地分析人體類固醇激素的內暴露水平。尿液類固醇激素的分析檢測方法主要包括基于色譜-質譜技術開展的靶向分析和非靶向分析。近年來，尿液類固醇激素的檢測前處理技術開發和檢測分析技術創新等方面都取得了長足的進展，如LC-MS/MS技術的發展，可以省略前處理過程中復雜的水解和衍生的步驟，從而直接定量尿液中的類固醇激素及其代謝物。這將有助于識別更多類固醇激素，從而更全面、準確地了解人群健康狀況和疾病風險，為公共衛生政策制定、健康干預和風險管理提供科學依據。

　　未來，尿液類固醇激素檢測領域的發展可聚焦于以下幾個方向:

　　a) 制定標準化程序以規范尿樣的采集和儲存。已有研究表明，不同類固醇激素穩定性不同，有些物質可能對采樣和儲存條件較敏感，但尚缺乏一致的尿樣采集和儲存標準流程。建立標準化采集和儲存方法將有助于提高樣本的一致性和可比性，從而保障后續類固醇激素分析的準確性和可信度。

　　b) 加速新型前處理方法的研發。作為檢測不可或缺的步驟，高效的前處理技術是實現從基質中充分提取目標物的關鍵。尿液類固醇激素及其代謝物的前處理過程影響因素眾多，未來的研究應致力于推動前處理技術向自動化、高通量、低溶劑使用量以及環境友好的方向不斷發展。

　　c) 推動靶向和非靶向篩查方法的標準化進程。盡管基于質譜-色譜技術的靶向和非靶向分析已取得顯著進展，但當前仍面臨確立更全面、一致的標準流程的挑戰。未來應推動建立高效、可重復的標準化篩查流程，以提高代謝物的識別和檢測效能。

　　d) 合成多種標準品和同位素，并持續完善公共數據庫信息。增加類固醇激素及代謝物的標準品和同位素的種類可以提高實驗結果的可靠性，以滿足精確定量的需求，同時結合公共數據庫信息有助于確保檢測結果的全面性。