基于計算機蛋白質設計實現溫和條件下微塑料的生物降解

　　塑料工業在給人類社會的生活、生產帶來方便的同時，導致大量廢舊塑料垃圾的產生。由于其固有的硬度、強度、耐用性及穩定性需求，廢棄塑料制品無法自動降解，長期暴露對環境造成嚴重危害。目前，塑料垃圾的處理方式通常是填埋和焚燒，這種“生產-廢棄-處理”的單向過程不符合循環經濟的理念，無法從源頭解決“白色污染”問題。

　　2004年，英國普利茅斯大學教授Richard C.Thompson等人在Science上發表短文，提出“微塑料”的概念。大量不可降解的微小塑料碎片（~20 μm）在環境中逐步轉移到土壤和海洋，最終進入生態圈和食物鏈，被包括人類在內的生物攝入，威脅人類健康和動植物的生存，發展綠色生物降解策略已成為生態、環境等領域的迫切需求。2016年，日本京都工藝纖維大學Kohei Oda團隊在Science報道了首個在30°C下可有效降解低結晶度PET塑料的IsPETase降解酶，然而，該酶穩定性差，無法滿足生物降解實際應用需求。

　　中國科學院微生物研究所研究員吳邊團隊提出一種提出新型蛋白質穩定性計算設計策略（greedy accumulated strategy for protein engineering, GRAPE）（圖1），基于計算機蛋白質設計對IsPETase進行了穩定性改造，獲得了魯棒性顯著增強的重設計酶，為拓寬生物降解塑料的應用場景提供了新思路。科研人員采用融合策略，綜合使用四種不同的單點預測算法輔以結構缺陷分析，預測了85個潛在有益突變。經過對預測突變的實驗檢驗，獲得了21個有益單點突變（ΔTm ≥ 1.5°C）。通過K-means聚類算法，科研人員將21個有益單點突變分為3個Cluster，并依據貪婪算法（圖2）對每個Cluster進行迭代疊加。經過10輪迭代疊加，科研人員獲得熔融溫度提高31°C的IsPETase突變體（命名為DuraPETase）。在溫和條件下，DuraPETase對30%結晶度PET薄膜的降解效率相較于野生型提升了300倍（圖3B）。通過掃描電鏡可觀察到，經DuraPETase處理后的PET薄膜內部結構發生了顯著的腐蝕變化（圖3D）。科研人員對DuraPETase蛋白晶體結構進行解析（圖4），驗證了突變體活性位點區域氨基酸之間協同相互作用，探究了DuraPETase性能改善的分子機制。該研究實現了2g/L微塑料在溫和條件下的完全降解，為廢水中微塑料的預處理提供了新的處理思路。

　　GRAPE策略的優勢在于運用聚類算法和貪婪算法，對計算獲得的有益突變體進行系統聚類分析，再結合貪婪算法進行網絡迭代疊加，大幅規避了不同突變位點間的負協同相互作用，在較短時間內最大限度的探索序列空間疊加路徑。該研究為計算機輔助蛋白質改造提供了新思路，并為進一步了解和推進自然環境中的聚酯水解提供了有價值的工具。

　　相關研究成果發表在ACS Catalysis上，并被選為當期封面文章。微生物所助理研究員崔穎璐及博士研究生陳艷春為論文共同第一作者，吳邊為論文通訊作者。微生物所研究員向華、唐雙焱、杜文斌，天津工業生物技術研究所研究員劉衛東團隊，中國科學技術大學教授劉海燕團隊，南京大學教授梁勇團隊以及美國加利福尼亞大學教授Houk為研究工作提供了重要指導和幫助。研究工作得到國家自然科學基金委員會與歐盟合作項目“合成塑料降解轉化微生物菌群”、國家重點研發計劃、國家自然科學基金優秀青年項目和面上項目、中國科學院戰略生物資源服務網絡計劃生物資源衍生庫項目，以及北京市自然科學基金項目的支持。

圖1. GRAPE 策略示意圖

圖2. 貪婪算法示意圖

圖3.（A）DuraPETase相較于野生型IsPETase在不同溫度下對30%結晶度PET薄膜的降解性能；（B）DuraPETase及野生型IsPETase在37°C條件下對30%結晶度PET薄膜的降解曲線；（C）DuraPETase及野生型IsPETase在有機溶劑中的降解性能；（D）PET薄膜在緩沖溶液對照；野生型IsPETase；DuraPETase；DuraPETase+5%甲醇溶劑中孵育10天的掃描電鏡圖；（E）DuraPETase及野生型IsPETase對納米塑料及微塑料的降解曲線

圖4.（a）W159H，（b）I168R-S188Q，及（c）S214H-L117F-Q119Y突變的結構分析，黃色、綠色、藍色分別代表野生型IsPETase，DuraPETase晶體結構及DuraPETase的分子動力學模擬軌跡構象