基于質譜技術蛋白質定量方法的研究進展

朱金蕾1  張鍇1*何錫文1 張玉奎1,2 1南開大學化學學院，天津市衛津路94號，300071 2中國科學院大連化學物理研究所，遼寧省大連市中山路457號，116023 摘要   質譜技術已經成為目前蛋白質鑒定的重要工具。定量分析細胞內蛋白質組的動態變化，是當前研究蛋白質功能、揭示細胞生物機理、尋找疾病蛋白標記物和藥物靶標的迫切需要。本文綜述了基于質譜技術蛋白質定量的策略、方法和應用等方面近年來的進展，評述了幾種蛋白質質譜定量方法的特點和應用潛力。 關鍵詞   質譜，蛋白質組學，定量，同位素標記   1 引 言 細胞內蛋白質組豐度的動態變化對各種生命過程有重要影響，當前蛋白質組的定量分析研究已經引起廣泛關注，這為分析化學帶來了新的挑戰和機遇，基于質譜的蛋白質分析技術也從蛋白質組的鑒定發展到定量蛋白質組學(quantitative proteomics) 研究[1,2]。目前定量蛋白質組學的方法主要是利用同位素標記結合質譜分析完成的，本文就基于質譜蛋白質定量技術的新進展進行評述。 2 凝膠電泳定量方法 凝膠電泳法(gel electrophoresis)是傳統的蛋白質分析方法[3]。凝膠電泳與質譜技術的結合使其應用更加廣泛[4]。隨著新的染色試劑的出現，使得凝膠電泳技術有了新的發展。例如Schulenberg發現了一種小分子的熒光染料(Pro-Q Diamond dye)可對磷酸化蛋白質特異性染色，經凝膠電泳分離、MALDI-TOF質譜鑒定，發現了復雜生物樣本體內新的磷酸化蛋白[5,6]。 傳統凝膠電泳技術定量蛋白質快速簡單，但存在諸多困難，例如難以檢測疏水的膜蛋白、低豐度蛋白，以及一些極酸和極堿性的蛋白；染色方法的動態范圍最多只能達到3個數量級，不能滿足實際樣品的定量要求。 3 同位素標記的質譜定量方法 3.1 同位素代謝標記法 同位素代謝標記以同位素元素或同位素標記氨基酸形式摻入到細胞培養基中，在細胞生長代謝過程中完成蛋白質同位素標記。Oda等[7]在酵母細胞培養基中摻入15N作了初步嘗試。Mann的研究小組發展了一種以氨基酸形式摻入的同位素代謝標記法[8,9](SILAC, stable isotope labeling by amino acids in cell culture)。其基本原理(圖1)：分別用輕型和重型同位素標記必需氨基酸，作為不同方法處理的細胞培養基原料，經多次細胞倍增周期和代謝過程，重型同位素標記的氨基酸完全轉移到細胞新合成的蛋白質中。不同標記的蛋白按照一定比例混合后，一同處理，經分離純化后，進行質譜鑒定和定量。通過對氨基酸序列相同、不同同位素標記肽段豐度的比較，可以得到細胞內各種蛋白在不同處理過程中表達的定量關系。  

 

 

圖1 SILAC法標記13C6-Lys基本原理[9]

Figure 1 the basic principles of SILAC with 13C6-Lys. 

 

         SILAC法最初是標記哺乳動物的培養基細胞[8]，后來漸漸發展到標記細菌[10]、酵母[11]、植物細胞[12]。近來，SILAC標記法結合液質聯用技術已在解決生命科學疑難問題方面顯示作用，例如，對酵母信息素和干細胞分化過程中磷酸化蛋白的定量，蛋白質之間合成與降解的分析等[13]。SILAC法不但可以用于檢測特殊的功能蛋白質在某些生物過程中的動態變化[14~16]，而且可以用來描述大腦組織中整體蛋白質組的藍圖[17]。

        SILAC法與多種質譜技術相結合應用廣泛。2008年，Kruger[18]等結合線性離子阱傅立葉變換高磁質譜（LTQ-FT）將SILAC方法拓展應用于哺乳動物體內，并以三種基因表達缺陷的小鼠為模型進行差異性標記，明確證實了相關組織中相應蛋白質的表達缺失信息。Mann[19]小組將SILAC法結合高分辨LTQ-Orbitrap質譜應用于鼠科胚胎干細胞研究，成功鑒定并定量出胚胎干細胞中的5111種蛋白質，這個數量是以往分析結果的三倍。Olsen等[20]采用SILAC法標記結合LTQ-FT質譜定量研究了HeLa 細胞在表皮生長因子刺激后的蛋白變化，檢測到2244個磷酸化蛋白上的6600 個磷酸化位點，其中14%的磷酸化位點在EGF 刺激后有2 倍以上的差異，揭示了HeLa 細胞中的磷酸化蛋白受EGF 影響的一個動態過程。Uitto等[21]運用SILAC法結合基質輔助激光解析電離串聯飛行時間質譜（MALDI-TOF/TOF）定量研究了卵巢癌細胞系中的蛋白表達水平，發現SILAC法具有較高的重現性。

        就SILAC的機理而言，以氨基酸為原料的細胞培養基，均可用SILAC法標記(目前多采用精氨酸和賴氨酸標記)。從目前的文獻報道來看，SILAC法彌補了質譜在定量方面的局限，與分析和生化處理過程具有很好的兼容性， SILAC法標記效率高、損失小；標記誤差低，可靠性高。其不足之處在于：一是只適用于活體培養的細胞，對于生物醫學研究中常用的組織、體液等樣品難以處理，二是對于動物模型的標記成本太高(表1)。但是，SILAC結合HPLC/MS/MS技術已發展為當前生物醫學精確定量蛋白質的最有效方法之一。  

表1 蛋白質相對定量方法的比較

方法	標記的同位素	標記方式	優點	缺點	參考文獻
凝膠電泳法	無	無	快速簡單，易觀測，成本較低。	靈敏度低，難以檢測疏水性膜蛋白、低豐度蛋白。	[3] [4]
同位素代謝標記法	12C (13C) 14N(15N) 1H (D)	體內標記	標記效率高，誤差低，沒有放射性。	僅適用于活體培養細胞，成本較高。	[8] [9][13]
同位素親和標簽法	1H (D) 12C (13C)	體外標記	適于多種類型的樣品。	僅適用于含半胱氨酸的蛋白分析，數據檢索復雜。	[22][23]
酶催化18O同位素標記法	16O (18O)	體外標記	操作簡單，副產物少，適于低豐度磷酸化肽段的分析。	受酶解過程和條件影響較大， 18O原子摻入個數具有不確定性。	[38][43~45]
同重同位素標簽標記定量法	12C (13C) 14N(15N) 16O (18O)	體外標記	可同時標記四種不同樣品，蛋白覆蓋率高，定量準確，可信度高。	樣品預處理和酶解過程可能引起平行樣品之間有差別，造成結果偏差；成本較高。	[46][53]
非標定量法	無	無	簡單易行，無需同位素標記過程。	僅依據一級質譜和數據模型定量，重現性差，定量不準確；難以檢測低豐度肽段。	[54~57]

3.2 同位素化學標記法

3.2.1 同位素親和標簽法 同位素化學標記法是通過與氨基酸的功能團發生特殊的化學鍵合反應，將同位素標記物引入蛋白進行定量分析的一種體外標記方法。Gygi等[22]開發的同位素親和標簽 ICAT(isotope coded affinity tags)是目前應用較廣泛的化學衍生標記試劑。ICAT試劑主要由三部分構成(圖2A)：(1)親和標簽，用于ICAT標記多肽的提純過程；(2)連接子，用來整合穩定的同位素；(3)活性集團，用來特異結合巰基(半胱氨酸)。ICAT標記法的原理(圖2B)：首先，將不同狀態的細胞裂解，分別加入不同標記的ICAT試劑，反應后按照一定比例混合，然后將純化的蛋白組一起酶解，進行HPLC/MS/MS分析，可以定量分析不同狀態的細胞內蛋白的豐度變化[23]。       ICAT標記法不但可以用來分析整個細胞蛋白質的表達變化[24]，而且可對一些專門的亞細胞組分蛋白質做定量研究，諸如染色質[25]、線粒體[26,27]和脂筏[28]等。 ICAT法與各類質譜的聯用也很廣泛。例如采用ICAT法結合四極桿-飛行時間串聯質譜（Q-TOF）對平滑肌細胞脂筏蛋白[29]、硫氧化還原蛋白Trx(thioredoxin)[30] 進行的定量研究。Fu等[31]用ICAT技術結合MALDI-TOF/TOF質譜，鑒定出心臟組織中63種氧化還原敏感性蛋白，為進一步研究氧化還原介導對細胞調控的過程提供了廣闊前景。最近，Lynn等[32]利用ICAT試劑借助LCQ離子阱質譜，對有關老年癡呆癥發病機理的線粒體蛋白進行了定量分析，并對影響因子早衰素 (presenilin-1)作了進一步探討。Prahalad等[33]采用ICAT標簽結合LTQ質譜對骨髓單個核細胞(BMMNC)、骨髓混合細胞產物(BMMCP)中的蛋白進行鑒定定量，鑒定出638 種BMMNC蛋白，867種BMMCP蛋白。Yang等[34]利用ICAT試劑結合LTQ-Orbitrap質譜鑒定出37種蛋白在E.sakazakii桿菌中表達異常，并與2-DE結合MALDI-TOF質譜的鑒定結果進行比較，指出兩種方法各有優勢又相互補充。 從ICAT標記技術的文獻報道來看，ICAT法適合多種類型樣品，如體液、活體組織等。但是ICAT 試劑存在一些不足：一是不能分析半胱氨酸缺失的蛋白質；二是ICAT試劑分子量約為500Da，這會增加數據庫搜索的復雜性，為此，出現了可剪切ICAT試劑(cleavable isotope coded affinity tags, cICAT)[35,36]，用可被酸剪切的官能團代替ICAT試劑中的聚醚鏈接減少了難以解析的碎片離子數量； 9個13C取代8個氘原子，使輕、重同位素試劑質量相差9Da提高了質譜分辨率。Gygi等[36]運用cICAT試劑研究了鹽度脅迫(salinity stress)對酵母細胞蛋白表達情況的影響，鑒定并定量出560種蛋白。基于ICAT試劑或cICAT試劑合成成本太高, Guaragna等[37]合成了BAA-ICAT(beta-alanine-arm-ICAT)試劑，合成流程簡單方便，殘基穩定易檢測。 3.2.2 酶催化18O-同位素標記法 該 方法是通過加入H218O，在蛋白酶催化作用下將羧基上的2 個16O替換成18O，使肽段質量數相差4Da[38]。18O標記過程大致可分為兩種：酶切過程中標記和酶切后標記，前者的酶切和標記反應在同一個反應 體系中同時進行, 而后者把酶切和標記反應的體系分開，酶切和標記條件可以分別優化，在復雜樣本的標記中應用廣泛[39,40]。

 

18O標記法也可與多種質譜配合使用。Fenselau等[41] 應用18O標記結合FT-ICR質譜技術研究了腺病毒蛋白的相對表達水平，利用Q-TOF質譜進行單個碎片離子掃描，鑒定出腺病毒蛋白上的一些修飾位點、氨基酸序列等。Korbel等[42]采用18O標記和Q-TOF質譜結合免疫共沉淀反應來分析紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)受體依賴的蛋白質，鑒定了187個磷酸化蛋白，并定量分析了89個酪氨酸磷酸化修飾與EPO受體依賴性的動態關系。Sui等[43]建立了一種18O-IPG-IEF-LTQ-FTICR的磷酸化蛋白定量技術，實現了HepG2細胞中磷酸化肽段的有效定性和定量。Sakai等[38]結合LCQ質譜將18O標記法和ICAT法對比，發現18O標記法較ICAT法分辨率高、同位素效應小。

從18O同位素標記法相關研究發現，用18O進行同位素標記會產生標記一個氧原子和兩個氧原子不等的現象，為此，Liu [44]等研究了一種雙重18O標記方法，使用二乙三胺五乙酸雙酸酐(DTPA)修飾多肽N端，使其在MALDI-TOF/TOF二級質譜分析時只產生y-系列離子，具有很好的檢測靈敏度和準確性。Qian等[45]對影響18O標記的實驗條件進行了優化，發現除C-末端肽段外絕大多數肽段可達到100%標記，并得出16O/18O 成對肽段峰強度在10倍動態范圍內標記率的RSD<18.4%。綜上所述，18O 標記技術操作簡單，反應條件溫和副產物少，便于與磷酸化肽段富集方法聯用，適于低豐度磷酸化肽段的定量標記。 3.2.3 同重同位素標簽標記定量法 同重同位素標簽標記定量法(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)是一種對氨基酸N端和賴氨酸殘基進行酶解后同位素標記的技術[46]。iTRAQ試劑包括三部分(圖3)：報告基團、平衡基團和肽反應基團。不同的報告基團(分子量分別為114Da, 115Da, 116Da, 117Da)分別與相應的平衡基團(分子量分別為31Da, 30Da, 29Da, 28Da)相配，保證總分子量為145Da。肽反應基團將iTRAQ標簽與肽段的N-端基團和每個賴氨酸側鏈相連，可標記所有酶解肽段。HPLC/MS/MS分析后，根據母離子的MS/MS可以鑒定出四個子離子峰，由相應的報告基團離子的質譜峰強度可以推算出四種肽段的相對濃度。       已報道的文獻中，iTRAQ標記法多與TOF質譜聯用。Fisher 等[47]用iTRAQ標記法結合MALDI-TOF/TOF質譜技術對唾液中的內源性多肽進行了定量分析，考察了采集時間對多肽豐度的影響。Zhang等[48]將iTRAQ技術與Q-TOF技術結合，定量分析了表皮生長因子受體蛋白上酪氨酸的磷酸化位點，鑒定出58種蛋白上78個酪氨酸磷酸化位點，在此基礎上又鑒定了26個酪氨酸磷酸化位點和18種蛋白。Bouchal等[49]基于iTRAQ