基于PCR的DNA文庫篩選實驗方法

PCR 混合物PCR 引物寡核苷酸雜交寡核苷酸PCR 正對照PCR 主要混合物蒸餾水

瓊脂糖凝膠電泳設備

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

蒸餾水

2. 酶和酶緩沖液

PCR 混合物（可以放在一起冰凍），對于 lml 反應，包括：200nmol 的各種 dNTP;1XVent 溶液或等價物；2.5umol 的 MgCl₂；2nmol 的各引物

PCR 主要混合物（每個反應必須新鮮配置）：lulVent DNA 聚合酶或等價物；99ul 上述 PCR 混合物

3. 核酸和寡核苷酸

2 個 PCR 引物寡核苷酸

1 個雜交寡核苷酸

PCR 正對照：10ng 全基因組 DNA 或能產生陽性 PCR 信號的起始文庫組分（見第 5 步）

4. 培養基

LB，1L 水中加入：10 g 蛋白胨、5 g 酵母抽提物、10 gNaCl, 用 NaOH 調節 pH 至 7.5SM,1L 水中加入：5.8 gNaCl、2 gMgS0₄、50 ml1mol/LTris-HCl(pH7.5)、5 ml2% 的明膠。

含10mmol/LMgSO₄ 的 LB

5. 特殊設備

瓊脂糖凝膠電泳設備，包括溴化乙錠

6. 其他

96 孔板（CorningCostar)

聚酯封口膜（NalgeNuncInternational)

噬菌斑雜交所需材料

7. 載體和細菌菌株

用噬菌體載體構建的 DNA 庫

用于擴增文庫的細菌菌株

二、方法

在篩選 DNA 文庫之前，需要測定幾個參數來建立有效的實驗條件。這些參數如下。

1.PCR 條件。用篩庫的引物改變退火溫度和循環次數，以得到最大量的特異產物。模板的來源可以是將要篩選的文庫（10⁶ 個噬菌體顆粒）或者是 1ng 的全基因組 DNA。在PCR 過程中，噬菌體 DNA 釋放作為模板。因此，在反應之前不需要提純噬菌體 DNA。可以使用的典型引物應該產生 0.1~1.0kb 的產物（16~24 個核苷酸長度，50%G+C 含量）。如果需要（比如，當用與不同外顯子配對、橫跨一個大的內含子的引物時），目的序列可能比1kb 長，但產物的量可能會減少。

2. 確定文庫中基因的豐度。用上面所建立的 PCR 條件，通過改變加入噬菌體的數目定量文庫。能產生 PCR 產物的噬菌體的最小數目就是實驗確定的該基因在文庫中的豐度。對于一個插入片段平均為 20kb 的基因組文庫來說，要有大于 10⁵ 的復雜度，以確保目的基因至少出現一次。對一個高復雜度的典型文庫來說，用 10^4~10⁶ 個噬菌體做模板，可以顯示基因在庫中的豐度。加入的含有一個或兩個目的基因拷貝的噬菌體的數目，應該用作文庫篩選。

一旦確定了 PCR 條件和基因的豐度，就可以按照如下方法進行文庫篩選。

1. 取 0.5 ml 新鮮的、在 LB 中過夜培養的細菌培養物，與 0.5 mlSM 混合，加入含有文庫的噬菌體，室溫溫育 20 min。

2. 加入 20 ml 含 10 mmol/LMgSO₄ 的 LB，按 8X8 矩陣分裝到 96 孔板中，每孔 100ul。將板用聚酯封口膜密封，37°C 225r/min 振蕩培養 5~6 h, 對噬菌體進行擴增。擴增之后，噬菌體的濃度應該增加到大概 10⁹ 個/ml。大概有 1/3 的培養物能被均分進 96 孔板，在計算步驟 1 的加入噬菌體數時應當考慮到這一點。

3. 將一排或一列 8 個孔中的噬菌體（每孔 25ul) 用多孔移液器混合（參看討論部分的可變樣式）。在這一步中，當取掉封口膜和移液時，一定要特別小心，以避免樣品交叉污染。如果想避免交叉污染，可以將板子短暫離心，以幫助清除封口膜上的液體。用聚酯封口膜將板子重新封閉，在 4°C 可以保存 1 個月。

4. 用蒸餾水按 1:1 稀釋噬菌體，現在噬菌體就可以用作 PCR 模板了。

5. 在 24.5ul PCR 主要混合物中加入 0.5ul 的模板（噬菌體），用上面建立的 PCR 條件進行 PCR。每個實驗需要有一個負對照（不加模板）和一個正對照（即能產生陽性信號的10ng 的總基因組 DNA 或一小份的起始文庫）。

6. 通過瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR 產物。用溴化乙錠染膠并拍照（Sambrook and Russell2001)。

7.70°C 其空干燥凝膠，變性 DNA, 然后將寡核苷酸探針（末端用 32P 標記）用標準的DNA 雜交條件與干燥的凝膠直接進行雜交，洗滌，然后放射性自顯影 [這一步的技術細節可以參看 Israel(1993)]。用溴化乙錠染色很容易就能看到特異的 PCR 產物時，這一步是可以選做的，下面會有討論。也可以用標準技術將 DNA 轉移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上后再進行雜交。

笫 6 步和/或第 7 步東得的數據應該能鑒定出含有目的基因的亞庫（見討論部分笫一輪的篩選現在就完成了，與起始文庫相比陽性亞庫中的基因已經被富集了，后續的篩選循環是 1~7 步的重復，在擴增的亞庫噬菌體定量之后就可以進行。

8. 通過噬菌斑法確定陽性孔中的噬菌體的量（Sambrook and Russell2001)。

9. 用約為上一輪數量 1/30 的噬菌體侵染細菌，開始下一輪的篩選。

10. 重復 2~9 步。