基因克隆技術

一、目的基因的獲得

目的基因是指所要研究或應用的基因，也就是將要克隆或表達的基因。獲得目的基因是分子克隆過程中最重要的一步。目前用于獲得目的基因的方法有幾種，如限制性內切酶直接分離法、文庫篩選法、體外擴增法和人工合成法等，其中限制性內切酶法直接分離目的基因和多聚酶鏈式反應（PCR）或逆轉錄-多聚酶鏈式反應（RT-PCR）體外擴增目的DNA片段是目前最常用的方法。

（一）采用限制性酶切法直接分離目的基因

1. 從原核基因組中制備　原核基因組相對較小，用幾種限制性內切酶分別消化原核基因組，或用某種限制性內切酶對所要研究的基因組進行部分消化，可以得到大小不等的各種片段，其中有些片段就會含有目的基因，將這些片段插入載體中進行克隆，經過篩選，可以得到所需的目的基因。

2. 從真核基因組中制備　真核基因組比較大，直接用限制性內切酶消化后需要篩選的克隆數太多，不易操作。可以用一種限制性內切酶先消化基因組DNA，產生連續的DNA片段，然后電泳分離這些DNA片段，再用一段特異探針與這些DNA片段進行雜交，在含有特異性模板的區域就會出現雜交帶，可以初步鑒定基因組中是否含有目的基因。

我們也可以將酶切后的基因組DNA片段全部克隆入適當的載體中，制成基因組文庫，再用特異性探針與基因組文庫中的不同克隆進行雜交，陽性克隆即表示克隆到的DNA片段含有特異基因序列。將陽性克隆測序，用第一個克隆片段的末端分離下一個克隆片段，然后利用DNA片段間的重疊順序來鑒定其他克隆。這樣一步步走下去，最終可得全部基因序列，這種技術叫做染色體步移（chromosome walking）。

（二）采用PCR或RT-PCR方法制備目的基因

根據已發表的基因序列設計并合成引物，采用PCR（以基因組DNA為模板）或RT-PCR（以mRNA為模板）從組織或細胞中獲取目的基因片段用于基因操作，這是實驗室中最常用的獲取已知基因的方法。

利用PCR獲取目的基因的一大優點就是可以根據需要在引物序列上設計適當的酶切位點、起始密碼子或終止密碼子等，或通過人為錯配改變堿基序列（人工突變）對目的基因進行有限修飾。對于未知基因，可采取構建RT-PCR文庫的方法獲得未知基因：利用mRNA末端poly A序列尾設計共用引物，將所有mRNA逆轉錄成cDNA，利用各種工具酶在cDNA末端加尾，然后采用一對共用引物擴增所有cDNA片段，將經PCR擴增后的片段插入到適當載體中，構建成PCR-cDNA文庫。這種方法的優點是可以將表達水平很低的mRNA擴增出來，有利于篩選出表達豐度低的基因。由于經過PCR擴增，基因序列的精確性需要采用其他方法進一步確定。

還有一個獲得目的基因的方法是利用計算機技術進行“計算機克隆”，即利用GenBank中的基因信息，通過軟件比較不同種屬基因之間的相似性（同源性），利用保守區序列設計引物，再用PCR或RT-PCR從不同種屬或不同組織細胞中獲取未知的基因片段。這是目前可實現的一種獲得新基因的捷徑。

（三）基因組文庫或cDNA文庫的構建和篩選

將基因組DNA用限制性內切酶消化后插入到適當載體中，得到含有不同插入片段的克隆載體，這種克隆載體的混合物含有長短不同的基因組片段，這就是基因文庫。若將細胞內所有mRNA均逆轉錄成cDNA，然后將所有cDNA片段克隆到適當的載體中，構建成含有不同cDNA片段的克隆載體混合物，這就是cDNA文庫。目前許多組織或細胞的基因組或cDNA文庫都可以從商業公司買到。

當獲得了基因組文庫或cDNA文庫，可以根據已知的信息合成特異性探針，采用核酸分子雜交的方法從文庫中篩選感興趣的基因片段，這仍是目前獲得新基因的一種常用手段。基因組文庫或cDNA文庫的構建和使用請參見本書相應的章節。

（四）化學合成法制備基因片段

采用DNA合成儀，對目的基因進行分段合成，然后進行連接，可以得到所需的目的基因。化學合成法可以改變原始的基因序列，甚至可以合成自然界不存在的序列。在合成過程中可以根據需要改變核苷酸的密碼子，如將真核基因序列中不易在E. coli中利用的稀有密碼子改成E. coli偏愛的密碼子，有利于真核基因在E. coli中的表達。

二、目的基因和載體的連接

獲得目的基因后必須將其放在一定的載體內才能在宿主細胞內擴增或表達。目的基因與載體的連接及其后續的轉化過程習慣上稱為克隆（cloning）。由于目前很多基因都是利用PCR技術獲得，因此這里先介紹PCR產物的克隆策略，然后再介紹其他的克隆方式。

（一）PCR產物的克隆策略

獲得PCR產物通常只是克隆的第一步。無論研究的起始材料是RNA還是DNA，最重要的是要有一種有效的方法對PCR產物進行克隆。目前已建立了多種對PCR產物進行克隆的方法，具體選擇哪種方法取決于以下幾個因素：PCR產物序列是否已知；載體上有哪些單一的限制性酶切位點可以利用；克隆PCR產物的用途等。

1. 限制性內切酶酶切位點添加法　對PCR產物進行克隆的一個基本方法是利用目的片段所特有的限制性內切酶識別位點對產物進行酶切消化。一般是在設計PCR引物時就要考慮到連接方式，直接在引物末端包含與載體相匹配的限制性內切酶位點。

設計PCR引物時必須考慮以下幾個因素：

①如果PCR產物序列未知，那么在引物上所提供的位點有可能會出現在產物DNA中，使用這些位點進行酶切時將會導致產物內部切割，產生缺失的克隆。

②如果酶的識別位點靠近DNA末端，內切酶對DNA產物的切割效率會降低。可用Klenow酶、T4多聚核苷酸激酶及T4 DNA連接酶等處理PCR產物來克服這一缺陷：首先用激酶對PCR產物進行處理，然后將PCR產物分子上的突出末端用Klenow酶補平，再用T4 DNA連接酶進行連接，形成由多個PCR產物組成的串聯體，這種多聚體能被所采用的內切酶有效地切割。

2. T/A克隆法　在PCR產物的克隆中，還可以利用含有單個胸腺嘧啶（T）3'突出端的線性化載體與帶有單個腺苷酸（A）3'突出端的DNA片段的連接來進行克隆，這種克隆系統被稱為T/A克隆。它利用了Taq DNA聚合酶具有延伸酶活性，即以不依賴模板的方式將一個核苷酸添加到已完成延伸的PCR產物的3'末端。對于多數DNA聚合酶，這個添加上去的核苷酸通常是A殘基。

有幾種酶可用來產生3'端帶有單個T突出末端的線性化載體，分別是MboII、XcmI和HphI。另外還有兩種方法可產生帶3'-T突出端的載體，一種是將一個T殘基加到經過限制性內切酶線性化處理后產生平端的載體上，或者利用末端轉移酶加上一個雙脫氧胸腺嘧啶三磷酸（ddTTP）；另一種方法則是利用Taq DNA聚合酶具有的延伸酶活性，將一個A殘基加到DNA模板的3'端。為了在3'端加上一個T殘基，可在高濃度dTTP條件下，將平端載體與Taq DNA聚合酶共同孵育，在其他核苷酸不存在時，載體3'只能加上一個T殘基。目前，已有不少商業公司提供專門用于PCR產物克隆的T/A克隆載體。

（二）外源DNA片段和載體的連接

1. 黏性末端的連接　用一種適當的限制性核酸內切酶將目的基因和載體DNA消化，使它們兩端各具有相同的黏性末端，兩者的互補末端堿基配對，在DNA連接酶作用下，共價連接成新的DNA分子。

（1）單一酶切的黏性末端間的連接：載體分子與外源DNA用同一種限制酶消化后連接有兩個缺點：①載體DNA兩端的黏性末端可以自身退火，產生載體——載體相連接的假陽性克隆。為了減少和防止這種情況的發生，需用高濃度的外源DNA（插入片段與載體的比率一般為3:1），并用堿性磷酸酶將載體上的5'磷酸基團去掉。②不能定向插入。由于使用同一種內切酶，載體與插入片段的4個末端全為黏性互補順序，所以外源基因插入可有兩個方向。

（2）雙酶切的黏性末端間的連接：用兩種限制性內切酶消化載體和外源DNA片段，因黏性末端不同，載體分子和外源DNA片段只能按一種方向連接，這就是所謂“定向克隆”。

2. 平頭末端的連接　載體和外源DNA片段的末端是平頭也可以連接，但由于平端連接時反應更偏向于載體的自身環化，因此這種方法的效率要比粘端連接低。有幾種方法可提高平端連接的連接效率：①在連接反應中使目的基因片段分子數大大過量；②用堿性磷酸酶對載體進行處理，去除載體兩端的5'磷酸基團。

三、重組分子的擴增和鑒定

（一）重組DNA分子導入受體細胞

目的基因和載體在體外連接形成重組DNA分子后，需要被導入受體細胞中才能進行增殖和（或）表達。接受重組DNA分子的細胞稱作受體細胞或宿主細胞。受體細胞分為原核細胞（如大腸桿菌）和真核細胞（如酵母、昆蟲細胞及哺乳動物細胞）。原核細胞可作為基因復制擴增的場所，也可作為基因表達的場所；而真核細胞一般只用作基因表達系統。

受體細胞是重組基因增殖的場所，所以對受體細胞也應具有幾點要求：①容易接納重組DNA分子；②對載體的復制擴增無嚴格限制；③不存在特異的能降解外源DNA的內切酶體；④不對外源DNA進行修飾。由于載體的不同，所具備的篩選標志不同，所用的受體細胞也不同，因此可根據所用的載體選擇合適的受體細胞。

一般將重組DNA分子導入原核細胞的過程稱為轉化（transformation），而導入真核細胞的過程稱為轉染（transfection）。

未經處理的大腸桿菌很難接受外源重組DNA分子，但經物理或化學方法處理后，細菌對攝取外來DNA分子變得敏感了，這種經處理而易接受外源DNA分子的細胞叫做感受態細胞（competent cell）。

將重組DNA分子和感受態大腸桿菌細胞相混合，使重組DNA分子進入大腸桿菌中，就可以實現重組DNA分子的轉化。

（二）重組DNA分子的鑒定

重組DNA分子導入受體細胞后是否得到擴增，擴增后的重組DNA分子是否正確，導入的重組DNA分子是否含有正確的插入片段，重組DNA分子能否表達插入的目的基因，一般可以采用以下幾種方法對重組DNA分子進行鑒定。

1. 抗生素篩選　可根據所選用載體的特性，尤其是抗藥基因的存在與否進行初步篩選。例如載體具有抗氨芐青霉素的抗性基因，若轉化后的細胞能在含氨芐青霉素的培養基中生長，說明載體DNA被導入到了受體細胞中并且能夠擴增繁殖。但這種篩選并不能說明目的基因一定連接到了載體上。但通過抗藥基因的失活篩選可以證明有外源基因插入。

2. X-gal篩選　有些載體為了方便篩選，根據細菌乳糖操縱子原理，將LacZ基因構建到了載體的多克隆酶切位點處。如果目的基因連接成功，LacZ基因將由于目的基因的插入而失活，不能產生分解乳糖及其類似物的半乳糖苷酶，菌落在含有X-gal的培養基上呈現白色，無目的基因插入的克隆菌落為藍色。根據這種特性，可以基本判斷重組成功與否。

3. 酶切電泳鑒定　將重組DNA分子提取出來，用特定內切酶切割重組DNA分子并電泳。如果目的基因被成功地插入到了載體分子中，可以通過目的基因兩端的酶切位點將目的基因切割下來，經瓊脂糖凝膠電泳即可以判斷目的基因的存在與否，這是簡便而常用的鑒定方法。

4. 序列分析　經過初步鑒定后的重組DNA分子往往需要進行目的基因片段的DNA序列分析，通常采用多克隆酶切位點兩端的載體序列作為測序時引物的結合位點，即所謂的通用引物。有關DNA序列分析技術將在有關章節詳細敘述。一般需要表達的目的基因都必須經過DNA序列分析予以確認。

5. 其他方法　如采用核酸分子雜交或菌落原位雜交鑒定重組DNA分子，或采用蛋白印跡方法直接檢測目的蛋白的表達情況。