基因插入位點和模式實驗（一）

實驗材料 dCTP

試劑、試劑盒 乙醇次氯酸鈉β-葡萄糖醛酸酶基因活性測定液溴化乙錠

儀器、耗材 培養室MS 培養基

實驗步驟

一、轉基因插入位點的數目

第一代（ T0）轉基因植株外源基因的插入位點數目，一般都是通過遺傳方法進行鑒定。雖然遺傳分析可以在任何世代進行，但是一般選擇轉基因植株自交，或與野生型測交后得到的第二代（T1 ) 進行 。對代轉基因植株，統計目的基因表達與不表達的個體，可以獲得表型的分離比； 而對 T1 代轉基因植株，統計含與不含目的基因的個體，則可以得到群體基因型的分離比。在估測轉基因插入數目時，經常會采用前一種方法。但是，通過表型鑒定獲得的結果，經常會低于實際情況； 通過基因型鑒定所獲得的結果，則可以準確判定轉基因的插入數目。對 T0 代及其子代分析結果的比較，同樣也可以提供轉基因插入位點數的信息。最近幾年，精確評估轉基因插入數目，對發展 “基因清除”技術起了重要作用，這一技術主要是通過多個 T-DNA 區共轉化，獲得不含任何選擇性標記基因的轉基因植株。轉基因植株中外源基因的插入位點數與外源基因的拷貝數并非完全一致的，因為在同一插入位點有可能會含有多個拷貝，也有可能是以單拷貝的形式插入多個不同的位點。

1. 轉基因表型的分離

T0 代轉基因植株自交或雜交可以獲得 T1 代，用代植株可以評價外源基因的表達情況。轉入植物基因組的任何外源基因都可以用乃代植株的表型來分析，篩選 T。代轉基因植株的選擇性標記基因，也常應用于鑒定 T1 代轉基因植株外源基因的表達。若目標基因的表型容易觀測的話，同樣也可以用于幾代轉基因植株的表型分析，如通過碘染試驗可以方便地觀測與植物淀粉合成相關基因的表型。卡那霉素和潮霉素等抗生素，也可以分別用于鑒定轉基因后代中含有卡那霉素基因和潮霉素基因等相關抗性基因的陽性植株（見注 1) 。另外，通過將草丁膦、磺酰脲或草甘膦等除草劑噴灑幼苗或涂葉，也可以快速地鑒定出含有 BAR、ALS 或 EPSP 等功能基因的轉基因植株。而 β-葡萄糖醛酸酶基因、LUC 和綠色熒光蛋白基因等報告基因通常用于檢測乃代植株的外源基因表達。無損傷表型鑒定，如觀測綠色熒光蛋白基因或 LUC 的表達，優于有損傷表型鑒定，如葡萄糖醛酸酶基因染色或抗性檢測，因為前者可用于外源基因未表達的代植株的后續分子檢測。

在事件 1 和事件 2 中，凡代轉基因植株由 T。代植株自交獲得，其 β-葡萄糖醛酸酶基因活性主要通過胚乳、葉片和根的組織化學染色方法測定。

( 1 ) 胚乳染色時，種子先用 70% 的乙醇殺菌 30s，然后用 50% 的飽和次氯酸鈉溶液浸洗 15 min，再用無菌去離子水洗三次，第三次漂洗后浸數小時。在超凈工作臺上用滅過菌的解剖刀將處理好的種子切成兩半，含胚的一半種子在 MS 培養基上獲得乃代幼苗，另外一半則用來 β-葡萄糖醛酸酶（GUS) 染色。經常人們會將胚乳和胚的表型放在一起進行比較，因為它們的基因型雖然相同，但是基因組倍性不同。

( 2 ) 對于根和葉的染色，則沒有必要對種子進行消毒；當然種子也可以先在 70% 的乙醇中洗 30s，然后用無菌的去離子水洗三次。對于一些物種，如小麥和大麥，先將種子置于濕潤的濾紙上 5℃ 暗培養 2~ 4 天，接著在 20~25℃ 的暗環境下萌發 5 天，然后在同樣溫度下每天 16 h 光照培養，5~7 天后收集根和葉片。這一方法優于胚乳染色，因為有些物種的種子（如小麥和大麥）對次氯酸鈉非常敏感。

( 3 ) 根據樣品的體積大小，分別將它們浸沒在加有 β-葡萄糖醛酸酶反應液的 96 孔、24 孔或 6 孔板上。

( 4 ) 樣品放在打開的平板上抽真空（71 mm 萊柱）10~15 min，37℃ 搖床上反應過夜。

( 5 ) 第二天，觀察 β-葡萄糖醛酸酶染色后的樣品。圖 13. 1 是事例 2 中 T1 代轉基因種子胚乳染色完成后所得的結果。

( 6 ) 轉基因插入位點的估測：根據 T1 代轉基因植株 β-葡萄糖醛酸酶活性的觀測結果可以得出一個分離比。根據觀測值與單基因孟德爾遺傳理論值（表 13. 1 ) 的卡方分析結果，可以判定單個基因的插入位點數（表 13.2)。在事例 2 中，幾代轉基因植株中，83 個單株具有 β-葡萄糖醛酸酶（GUS) 活性，而 17 個單株沒有（ 圖 13.1 ），這一結果表明轉基因插入位點應該是一個。盡管許多文獻上均采用此種分析方法，但值得注意的是，這一方法得出的結果只是對轉基因插入位點的一種估測 （ 見注2)。同樣是事例 2 , 進一步的分子檢測結果 （見 3.1 節中 “基于基因型的遺傳分析”）卻表明，事實上該次外源基因的獨立的插入位點應該是 2 個，而不是 1 個 ，因此根據表型得出的結果是不準確的。所以，真正的遺傳鑒定應該是基于對轉基因后代基因型而并非是表型的調查結果分析所獲得的。

2. 基于基因型的遺傳分析

表 13. 1 和表 13. 3 分別列出了 1 個或 2 個基因插入到 1 個、2 個、3 個或 4 個位點時，自交一代后的子代分離群體中，按照孟德爾遺傳規律分離的理論比值。乃代植株為研究對象，采用的分析方法為 PCR 檢測或者點雜交等分子檢測方法。由于采用分子手段對幾代植株的基因型鑒定比表型鑒定更為昂貴和費工（見 3 .1 節 “轉基因表型的分離”），因此，基于基因型的遺傳分析方法一般很少采用，盡管基于表型的分析方法有種種局限 （見注2) 。當然，可能的情況下最好將兩種方法結合在一起進行分析。下面我們將結合事例2 ，介紹此種分析方法的具體操作流程：

( 1 ) 轉基因植株的培育和表型鑒定分離結果的統計按照3. 1 節中轉基因表型的分離中步驟 2~5 進行。保證結果準確性的重要一步是，乃代植株不要選擇以使所有植株存活，并可以用于后續的實驗分析。因為抗生素或除草劑的篩選會殺死轉基因沉默的個體，從而導致遺傳分析的結果發生偏差（見注 2 ) 。在事例2 中，具有明顯 β-葡萄糖醛酸酶活性的 83 粒 T1 代種子（圖 13. 1) 應該是含有 β-葡萄糖醛酸酶基因的，因此無需進行進一步的分析。而 17 個不具有 β-葡萄糖醛酸酶活性的幾代植株則應該利用分子檢測手段作進一步的鑒定，以明確它們是因為 β-葡萄糖醛酸酶基因的沉默，還是確實不含有 β-葡萄糖醛酸酶基因而沒有表現出 β-葡萄糖醛酸酶活性。

( 2 ) 收集 17 個不具有 β-葡萄糖醛酸酶活性的代植株的葉片樣品，以及陰性對照（野生型植株）和經 PCR 檢測的陽性對照樣品，樣品的長度應該與 1.5 ml 的微型離心管匹配。

( 3 ) 按照產品的使用說明用 DNA 提取試劑盒抽取葉片樣品的基因組 DNA。

( 4 ) PCR 反應中應加入的 DNA 模板量根據各物種的基因組大小而定，25 μl PCR 反應體系中水稻基因組 DNA 的加入量通常為 25 ng，而大麥或者小麥則為 100~150 ng。

( 5 ) 每個 PCR 反應體系包括植物基因組 DNA，1x 的反應緩沖液（含 2.5 mmol/L MgCl2) ，250 μmol/L   dNTP，正、反引物各 0.4 μmol/L ( 如根據 β-葡萄糖醛酸酶基因設計），2 U Taq DNA 聚合酶。

( 6 ) PCR 的反應程序：DNA 樣品先 95°C 變性 1 min；接著是 95℃ 變性 30s、60°C 退火 30s、72°C 延伸 1 min，共 30 個循環；循環結束后，72℃ 最后延伸 10 min。

( 7 ) PCR 反應產物（5~10 μl）用 1%~1.2% (m/V) 含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠進行電泳分析（每 100 ml 凝膠加入 5 μl 溴化乙錠，瓊脂糖凝膠用 0.5X TBE 緩沖液加熱溶解），電泳時電壓為 80~100 V，時間約為 20 min。紫外燈下觀察（圖 13. 2) 到 17 個代檢測樣品中有 7 個單株含有葡萄糖醛酸酶基因卻沒有 β-葡萄糖醛酸酶活性（ 即 β-葡萄糖醛酸酶基因被沉默了）。

( 8 ) 可以利用植物本體單拷貝看家基因或者 RFLP 探針的引物重復步驟 5~7 對 DNA 樣品進行質量鑒定，以確保它們能夠成功地進行 PCR 擴增。通過對看家基因的擴增分析，結果表明從事例 2 中獲得的 10 個樣品可以進行 PCR 擴增（圖 13. 2) 。

( 9 ) 計算轉基因插入位點數：利用孟德爾遺傳規律的理論值（表 13. 1 ) 可以對所獲得的觀察值進行卡方檢測。事例 2 中，90 個 T1 代單株含有 β-葡萄糖醛酸酶基因，而 10 個單株不含，根據卡方檢測結果我們可以看出植物基因組中轉基因的插入位點應該是兩個，它們可以獨立地自由分離（表 13.2) 。