基因組DNA的純化與回收

實驗概要

質粒、噬菌體等經酶切，電泳；PCR產物經電泳后，常常需要對一些DNA電泳片段進行回收和純化，用于亞克隆、探針標記、測序等。DNA回收和純化常用方法有壓碎法、低融點瓊脂糖法、凍融法等，也有現成的試劑盒供應。

主要試劑

酚、氯仿、NaAc、無水乙醇、TE、Tris-HCl飽和酚、異丙醇、低融點瓊脂糖、DNA回收試劑盒等.

實驗步驟

凍融法：

 1.  紫外燈下仔細切下含待回收DNA的膠條，將切下的膠條（小于0.6g）搗碎，置于1.5ml離心管中;
 2.  加入等體積的Tris-HCl飽和酚（pH 7.6），振蕩混勻；

 3.  -20℃放置5-10min；

 4.  4℃離心10000g×5min，上層液轉移置另一離心管中；

 5.  加入1/4體積H2O于含膠的離心管中，振蕩混勻；

 6.  -20℃，放置5-10min；

 7.  4℃離心10000g×5min，合并上清液；

 8.  用等體積酚/氯仿、氯仿分別抽提一次，取上清；

 9.  加入1/10體積3M NaAc（pH 5.2）、2.5倍體積預冷的無水乙醇，混勻；

 10. -20℃，靜置30min；

 11. 4℃離心13000g×10min，棄上清，75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干；

 12. 加適量H2O或TE溶解沉淀。

 DNA回收試劑盒（QIAquick Gel Extraction Kit Protocol）：

 1.  紫外燈下仔細切下含待回收DNA的凝膠，置1.5ml離心管中，稱重。

 2.  加入Buffer QG（每100mg凝膠加Buffer QG 300μl），置50℃水浴10min。

 3.  若回收片段小于500bp或大于4kb，則需加入異丙醇（每100mg凝膠加異丙醇100μl），混勻。

 4.  將小柱放在2ml收集管上，將上述溶液加于柱上

 5.  4℃離心13000g×1min，棄去收集管中液體

 6.  加入500μl Buffer QG于柱上，4℃離心13000g×1min，棄去收集管中液體。

 7.  加入750μl Buffer PE于柱上，4℃離心13000g×1min，棄去收集管中液體。

 8.  4℃離心13000g×1min。棄去收集管。

 9.  將柱放于一新1.5ml離心管上，加50μl EB于柱上。放置1min，4℃離心13000g×1min。

 10. 取5μl 回收DNA電泳檢測。

注意事項

1. 紫外燈下切下含待回收DNA的凝膠時，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。
2. DNA在凝膠電泳中不能加EB，應當加相應的指示劑，切電泳條帶盡量要細，不要把多余的瓊脂切進去。
3. 取酚和氯仿時要帶一次性手套，因為酚和氯仿具有腐蝕性。