基因編輯界一大進步：幾乎對PAM無依賴性的Cas9變體

　　CRISPR-Cas系統被譽為新一代的遺傳學工具。但是，CRISPR-Cas系統需要與靶標相鄰的PAM序列以促進Cas酶識別和結合至該位點。

　　CRISPR靶向特異性是由兩部分決定的，一部分是RNA嵌合體和靶DNA之間的堿基配對，另一部分是Cas9蛋白和一個短DNA序列，這個短的 DNA序列通常在靶DNA的3'末端發現，被稱為間隔序列前體臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM），它存在于病毒DNA中，但不存在于細菌DNA中，有助于防止細菌DNA被自身的免疫系統（CRISPR）切割。

　　PAM序列在我們的DNA中也很常見，因此CRISPR-Cas9已被用于編輯人類基因組，但是有一定的限制性，不接近PAM的基因不能作為靶點。沒有一個相鄰、可識別的PAM序列，Cas酶將無法識別或成功附著并切割所需的DNA片段。

　　包括經典的化膿性鏈球菌Cas9的變體（SpCas9）在內不同的Cas酶可識別不同的PAM序列，但基因組的大部分仍然無法設靶編輯或更容易產生脫靶突變。例如，SpCas9和SaCas9（來自金黃色葡萄球菌）所識別的PAM序列多含鳥嘌呤/胞嘧啶（G/C-rich），因此利用已報導的堿基編輯系統無法在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集（A/T-rich）區域進行精準堿基編輯操作。特別是最常用的SpCas9酶需要GG PAM序列進行識別，以至于其作用限制僅為基因組的9.9％，靶向區域十分局限。

　　為了克服這個障礙，過去麻省理工大學（MIT）的研究小組曾開發過一種名為SPAMALOT（Search for PAMs by Alignment of Targets）的分析軟件（通過目標隊列來搜索PAM），對細菌基因組進行生物信息學搜索，以尋找是否存在任何具有限制性較低的PAM的Cas9樣酶序列。然后，從生物信息學搜索中創建出最佳匹配的合成版本，并評估它們在CRISPR系統中的效用。但如果一個感興趣的基因組區域碰巧沒有合適的PAM，工程師就得求助另一種Cas酶。

　　現在，哈佛醫學院的生化學家Benjamin P. Kleinstiver博士領導的研究小組設計了不需要特定PAM就能結合和切割DNA的Cas9蛋白變體，命名為SpG和SpRY，能夠對絕大多數人類基因組進行不受限打靶，并具有單堿基對精度，從而糾正心臟病、II型糖尿病、骨質疏松癥和慢性疼痛等疾病的相關突變。

　　3月26日，科學家們在《Science》雜志發表了這篇具有重要意義的文章。Kleinstiver博士團隊用新方法糾正了過去位于“不可編輯”基因組區域的人類疾病相關突變。

　　“這些工程蛋白可以更自由地靶向過去不可接近的基因組區域，”Kleinstiver說。“通過幾乎完全放寬Cas酶對PAM的識別要求，基因編輯的應用被極大地拓展了。最令人興奮的意義是，從DNA編輯角度來看，全部基因組都可‘治療’了！”

　　“雖然未來需要更精確地闡明SpG和SpRY的氨基酸替換的分子作用，我們推測SpRY通過去除典型的堿基特異性相互作用，置換PAM DNA以促進相互作用來達到其擴大靶向的范圍，”作者指出。“在PAM主溝中，通過添加新的非特異性蛋白質：DNA接觸進行能量補償。更實際的是，當考慮用哪種酶進行需要打靶活性的實驗時，我們建議用野生型SpCas9用于承載NGG PAMs的站點，用SpG用于 NGH PAMs，用SpRY編輯剩余的NHN PAMs。”