基因表達系列分析實驗（SAGE）（一）

實驗方法原理

實驗材料 感興趣的細胞或組織

試劑、試劑盒 糖原EDTA緩沖液SDSBSATween 20連接子T4 DNA 連接酶BsmFIPC8SeeDNA乙酸鈉乙醇DMSOPCR引物乙酸銨DNA ladder 聚丙烯酰胺 TBE凝膠DNA參照pZErO-1 質粒TE緩沖SOC培養液Tris · Cl

儀器、耗材 微量離心管水浴鍋帶冷凍的熱控制 循環儀96 孔 PCR 板干冰 甲醇浴臺式離心機平臺型搖床UV 盒濾鏡Spin-X 離心過濾管微電擊杯Bio-Rad 基因脈沖電轉裝置培養管

實驗步驟

實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」

1. 刮取細胞時準備 Dynabeads ，洗滌緩沖液和 5×第一鏈緩沖液混合液（置于冰上）。

2. 充分懸起 Dynabeads oligo （dT）25，轉移 100 ul 到一個無 RNase 的硅烷化微量離心管里，置于磁座上。30 s 后去除上清，不要擾動磁珠。

3. 輕彈或輕輕渦旋把磁珠重懸于 500 ul 裂解/結合緩沖液中。把磁珠留在緩沖液里直到準備把它加到細胞裂解液里。加到細胞裂解液里前移出磁珠。

4. 在一個 2 ml 的微量離心管里用 1ml 的裂解/結合緩沖液裂解 100 000 ～ 1000 000 個細胞（或 2～10 mg的組織），用組織勻漿器勻漿 1 min。如果有必要的話，最高速離心 1 min 去除細胞殘渣。使用勻漿器前，徹底清洗，再用 100％ 的乙醇淋洗，用 1L 的 DEPC 處理的雙蒸水洗滌。

5. 立刻用一個 1 ml 的注射器使裂解液通過一個 23-G 的針頭撕裂基因組 DNA 。把洗過的磁珠和裂解液混合，室溫用手連續晃動溫育 3～5 min。

6. 把管子放到磁座上 2 min，棄掉上清（上清可以保存用作 DNA 的實驗）。

7. 用一個 P200 帶濾芯的吸頭上下吹吸洗滌磁珠。按下面的順序洗滌：

7.1 1 ml 含20 ug/ml 糖原的洗滌緩沖液 A（1 ml 洗滌緩沖液中加入 1 ug 20 mg/ml 的糖原），兩次。

7.2 1 ml 含20 ug/ml 的糖原的洗滌緩沖液 B， —次。

7.3 200 ul 1× 第一鏈緩沖液混合液（用 DEPC 水從試劑盒中的 5× 第一鏈緩沖液混合液稀釋），4次。

8. 把磁珠重懸于下面的第一鏈合成混合液里：

54 ul DEPC ddH2O

18 ul 5× 第一鏈緩沖液

9 ul 0.1 mol/L DTT

4.5 ul 10 mmol/L dNTP

把管子置于 37°C 2 min， 然后加入 3 ul 200 U/ul SuperScript II 逆轉錄酶。37°C 溫育 1 h， 每 10 min 用手混勻磁珠。把管子置于冰上中止反應。

9. 在冰上往第一鏈的反應里加入如下第二鏈合成的成分，次序如下：

227 ul ddH2O， 預冷

150 ul 5× 第二鏈緩沖液

15 ul 10 mmol/L dNTP

3 ul 10 U/ul E.coli DNA 連接酶

12 ul 10 U/ul E.coli DNA 聚合酶 I

3 ul2 U/ul E.coli RNase H

16°C 溫育 2 h， 每 10 min 用手混勻磁珠。

10. 溫育后，把管子置于冰上加入 100 ml 0.2 mol/L EDTA 中止反應。

11. 用含 0.1％ SDS 和 2× 乙酰化 的 BSA 的 1×BW 緩沖液洗一次（ 如果不加 BSA ，珠子會變得很黏）。

12. 用 500 ul 含 2×BSA 的 1XBW 緩沖液洗 3 次。重懸在 500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 緩沖液中，70°C 加熱 20 min 失活 Poll 的核酸酶活力。

13. 用 500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 緩沖液洗 3 次。然后用 200 含 2×BSA 的 1×NEB 緩沖液4 （隨 NlaⅢ 提供）洗 2 次（第一次用 NEB 緩沖液/ BSA 洗完后轉移到一個新管里）。取 5 ul 最后的磁珠懸液，用已知存在于所要建庫 cDNA 中的基因引物，PCR 檢查 cDNA 的完整性

14. 把磁珠重懸于下面的混合液中：

171 ul LoTE 緩沖液

4 ul 100×BSA

420 ul 10×NEB 緩沖液 4

5 ul NlaⅢ

37°C 溫育 1 h。

15. 溫育后，把管子置于磁座上約 30 S，然后用下面的溶液和 P200 帶濾芯的吸頭上下吹吸幾次洗滌：

500 ul 含 1％ Tween 20 和 2×BSA 的 1×BW 緩沖液，2 次

500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 緩沖液，4 次

200 ul 1×T4 DNA 連接酶緩沖液，2 次

最后重懸于連接酶緩沖液后，每個樣品轉移 100 ul 到 2 個新的硅烷化的微量離心管里。

16. 移棄最后的洗滌液，珠子重懸在下面的溶液里：

5 ul LoTE 緩沖液（兩管）

2 ul 5×T4 DNA 連接酶緩沖液（兩管）

3 ul 2 ng/ul 連接子 1A，B （已復性的；管 1）

3 ul 2 ng/ul 連接子 2A，B （已復性的；管 2）

17. 50°C 加熱管子 2 min 后置于室溫 5～10 min。每管中加入 1 ul 5 U/ul 高濃度 T4 DNA 連接酶，16°C 溫育 2 h。間歇混勻。

18. 連接后，置于磁座上約 30 s，然后每個樣品用 500 ul 含 0.1 ％ SDS 和 2×乙酰化的 BSA 的 1×BW 緩沖液洗兩次（第一次洗后合并管 1 和管 2，以減少后續步驟的損失）。

19. 用 500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 緩沖液洗 4 次 ； 用 200 ul 含 2×BSA 的 1×NEB 緩沖液 4 洗兩次（第一次用 NEB 緩沖液/BSA 洗后，轉移到一個新的管里）。

20. 65°C 預熱下面的混合液 2，重懸起磁珠：

170 ul LoTE 緩沖液

4 ul 100×BSA

20 ul 10×NEB 緩沖液 4

2 ul BsmIII

65℃ 溫育 1 h，間歇混勻。

21. 溫育后，最高速離心 2 min， 然后轉移上清到一個新的 1.5 ml 的微量離心管。用 40 ul LoTE 緩沖液洗一次，最后終體積為 240 ml。

22. 用 240 ul PC8 抽提，用 4 ul SeeDNA 乙醇沉淀：

22.1 加入 4 ul SeeDNA ［或 4 ul 3：1 （V/V） 的糖原和 SeeDNA 混合物］

22.2 加入 0.1 倍體積 3 mol/L 乙酸鈉（24 ul）， 混勻

22.3 加入 2 倍體積的 100％ 乙醇（480 ul）， 混勻

22.4 室溫溫育 2 min

22.5 最高速離心 5 min

22.6 70％ 的乙醇洗兩次，最后一次洗完后再離心一次，用吸頭小心地移出并棄去殘余液體，重懸于 10 ul LoTE 緩沖液。

23. 加入下面的混合液：

30. 5 ul ddH2O

5 ul 10×Klenow 緩沖液（或 Roche 緩沖液 H）

2.5 ul 10 mmol/L dNTP

1 ul 100×BSA

1 ul Klenow

37°C 溫育 30 min 后，加入 190 ul LoTE 緩沖液（240 ul 終體積）。

24. 用等體積（240 ul） 的 PC8 抽提。轉移 200 ul 到一個連接酶「＋」的管里，余下的 40 ul 到連接酶「-」的管里。

25. 用 2 ul SeeDNA、0.1 倍體積乙酸鈉和 2 倍體積的 100％ 乙醇沉淀。70％ 乙醇洗兩次，最后一次洗完后再離心一次，用吸頭小心移去殘余液體，晾干 5~10 min。重 懸于 2 ul LoTE 緩沖液。

26. 準備 2× 連接酶「＋」混合液：

2.5 ul 3 mmol/L Tris·Cl， pH 7.5

3.0 ul 5×T4 DNA 連接酶緩沖液

2.0 ul 5 U/ul 的高濃度 T4 DNA 連接酶

準備 2×連接酶「-」混合液：4.5 ul 3 mmol/L Tris ·Cl， pH 7.5 和 3.0 ul 5× T4 DNA 連接酶緩沖液。加入 2 ul 合適的混合液到＋/- 連接酶樣品里，在熱循環儀上 16°C 過夜（8～12 h）。

27. 連接后，加入 98 ul LoTE 緩沖液，優化 PCR 條件，然后進行大規模的 PCR 擴增。

28. 準備大規模 PCR 的反應混合液（2～3 個 96 孔板，每孔 50 ul 反應液），每個反應的成分如下：

5 ul 10×SAGE PCR 擴增緩沖液

3 ul DMSO

4.0～10 ul 10 mmol/L dNTP

1 ul 350 ng/ul PCR 引物 1

1 ul 350 ng/ul PCR 引物 2

用 ddH2O 調整體積到 49 ul

0.7 ul 5 U/ul Platinum Taq DNA 聚合酶

每孔分裝入 49 ul 反應混合液，然后加入 1 ul 適當稀釋的模板。

29. 熱循環儀運行如下程序：

1 輪：

2 min 94°C

26～32 輪：

30 s 94°C（變性）

1 min 55°C（復性）

1 min 70°C（延伸）

1 輪：

5 min 70°C（終產物延伸）

連接酶「-」的樣品應當擴增 35 輪。

不要對 Platinum Taq DNA 聚合酶使用傳統的熱啟動 PCR。

30. 把 PCR 反應物混合到一個 50 ml 的錐形管里，用 LoTE 緩沖液擴大體積到 11.5 ml， 然后用等體積的 PC8 抽提。