基因診斷的原理（一）

   核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方法之一。它的基本原理是：互補的DNA單鏈能夠在一定條件下結合成雙鏈，即能夠進行雜交。這種結合是特異的，即嚴格按照堿基互補的原則進行，它不僅能在DNA和DNA之間進行，也能在DNA和RNA之間進行。因此，當用一段已知基因的核酸序列作出探針，與變性后的單鏈基因組DNA接觸時，如果兩者的堿基完全配對，它們即互補地結合成雙鏈，從而表明被測基因組DNA中含有已知的基因序列。由此可見，進行基因檢測有兩個必要條件，一是必需的特異的DNA探針；二是必需的基因組DNA。當兩者都變性呈單鏈狀態時，就能進行分子雜交。

　　一、基因探針

　　基因探針（probe)就是一段與目的基因或DNA互補的特異核苷酸序列，它可以包括整個基因，也可以僅僅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉錄而來的RNA。

　　1．探針的來源 DNA探針根據其來源有3種：一種來自基因組中有關的基因本身，稱為基因組探針（genomic probe)；另一種是從相應的基因轉錄獲得了mRNA，再通過逆轉錄得到的探針，稱為cDNa 探針（cDNa probe)。與基因組探針不同的是，cDNA探針不含有內含子序列。此外，還可在體外人工合成堿基數不多的與基因序列互補的DNA片段，稱為寡核苷酸探針。

　　2．探針的制備 進行分子突變需要大量的探針拷貝，后者一般是通過分子克隆（molecular cloning)獲得的。克隆是指用無性繁殖方法獲得同一個體、細胞或分子的大量復制品。當制備基因組DNA探針進，應先制備基因組文庫，即把基因組DNA打斷，或用限制性酶作不完全水解，得到許多大小不等的隨機片段，將這些片段體外重組到運載體（噬菌體、質粒等)中去，再將后者轉染適當的宿主細胞如大腸肝菌，這時在固體培養基上可以得到許多攜帶有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通過原位雜交，從中可篩出含有目的基因片段的克隆，然后通過細胞擴增，制備出大量的探針。

　　為了制備cDNA 探針，首先需分離純化相應mRNA，這從含有大量mRNA的組織、細胞中比較容易做到，如從造血細胞中制備α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后，在逆轉錄酶的作用下，就可以合成與之互補的DNA(即cDNA)，cDNA與待測基因的編碼區有完全相同的堿基順序，但內含子已在加工過程中切除。

　　寡核苷酸探針是人工合成的，與已知基因DNA互補的，長度可從十幾到幾十個核苷酸的片段。如僅知蛋白質的氨基酸順序量，也可以按氨基酸的密碼推導出核苷酸序列，并用化學方法合成。

　　3.探針的標記 為了確定探針是否與相應的基因組DNA雜交，有必要對探針加以標記，以便在結合部位獲得可識別的信號,通常采用放射性同位素32P標記探針的某種核苷酸α磷酸基。但近年來已發展了一些用非同位素如生物素、地高辛配體等作為標記物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素標記的優點是保存時間較長,而且避免了同位素的污染。最常用的探針標記法是缺口平移法(nick translation)，其原理如圖13－1。首先用適當濃度的DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ)在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ（DNa poly merasⅠ)的5’→3’的外切酶活性，切去帶有5’磷酸的核苷酸；同時又利用該酶的5’→3’聚酶活性，使32P標記的互補核苷酸補入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的這兩種活性的交替作用，使缺口不斷向3’的方向移動，同時DNA鏈上的核苷酸不斷為32P標記的核苷酸所取代。

　　探針的標記也可以采用隨機引物法，即向變性的探針溶液加入6個核苷酸的隨機DNA小片段，作為引物，當后者與單鏈DNA互補結合后，按堿基互補原則不斷在其3’OH端添加同位素標記的單核苷酸，這樣也可以獲得比放射性很高的DNA探針。

　　二、限制性核酸內切酶

　　限制性核酸內切酶（restriction endonuclease)，又簡稱限制酶或內切酶。它們是基因工程和基因診斷重要的一類工具酶。它們的發現和應用為從基因組中分離目的基因提供了必要的手段.限制酶能特異地識別和切割特異的核苷酸序列，將雙鏈DNA切成較小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上，并被分離出來。

　　限制酶主要來源于原核生物，是一組能水解DNA磷酸二酯鍵的酶。迄今已發現的限制酶多達數百種，分為三類。在基因工程中使用的主要是第二類。限制酶根據其來源命名。例如，限制酶EcoRⅠ來源于大桿菌E.coli的RY13菌株,Ⅰ指在該菌株中分離的第一個限制酶。

　　下面是一些最常用的限制酶的來源及其識別順序(表13-1)

　　每種限制酶識別和切割的通常為4-6個核苷酸序列,稱為限制性位點(restriction sites)或切點.限制酶切割雙鏈DNA的方式有兩種，產生的末端也有兩種：第一種是交錯切割，即兩條鏈的切點不在同一水平而是相隔數個堿基，故斷口產生兩小段自身互補的單鏈，這種末端容易互補連接，稱為粘性末端（cohesive terminus)；第二種為平整切割，即兩　

表13-1 常用的限制酶的來源及其識別順序列

名稱

識別序列

來源

Ava 
C↓( C )CG( A )G
T G
Anabaena variabilis
Bam H G↓GATCC Bacillus amyloliquefaciens H
Bgl Ⅱ A↓GATCT Bacillus globigii
Eco RⅠ 
G↓ * ATTC
A
Escherichia coliRY13
Eco RⅡ 
↓CC( A GG
T
Escherichia coliR245
HaeⅢ 
GG↓ * C
C
Haemophilus aegyptius
HindⅢ 
* ↓AGCTT
A
Hemophilus influenzae Rd
HpaⅠ GTT↓AAC Haemophilus parainfluenzae
HpaⅡ 
C↓ * GG
C
同上
KpnⅠ GGTAC↓C Klebsiella pneumoniae
MboⅠ ↓GATC Moraxella bovis
PstⅠ CTGCA↓G Providencia stuartii
　　

*被甲基化

條鏈在同一水平切開，得到平齊末端（blunt terminus)(圖13－2)。由于具有相同粘性