基因診斷的原理（二）

發布時間：2020-08-25 09:20 原文鏈接：基因診斷的原理（二）

末端的DNA片段在DNA連接酶的作用下很容易共價連接，因此被廣泛地應用于重組DNA操作中。具有相同平齊末端的DNA片段也可以連接，但連接效率只有粘性末端連接效率的1％。

　　限制酶的上述特性在基因工程和基因診斷中具有重要用途：①首先不論DNA的來源如何，用同一種內切酶切割后產生的粘性末端很容易重新連接，因此很容易將人和細菌或人和質粒任何兩個DNA片段連接在一起，即重新組合，這是重組DNA技術的基礎。②人類的基因組很大，不切割無法分析其中的基因。限制酶能把基因組在特異的部位切開，即切割不是隨機的，因而從每個細胞的基因組得到的是相同的一組長度各異的片段。這些可能含有某一基因的片段可用電泳分離，并加以研究。③由于限制酶的特異性，如果識別位點的堿基發生了改變，限制酶將不再能切割；同樣，堿基的改變也可能導致出現新的酸切位點。在人類基因組中，這兩種情況是十分常見的，而切點的消失或出現將影響獲得的DNA片段的長度，表現為限制性片段長度多態性（RFLP)，這在基因的連鎖診斷中具有極重要的意義。

　　三、限制性片段長度多態性

　　一個人的兩套單倍體DNA是不完全相同的，一般每100－500個堿基對就有一個是不相同的。換言之，如果把兩套基因組DNA（各3.2×109bp)排列起來，那么平均有1000萬處不同，它們多位于內含子序列中。實際上，除單卵雙生子外，人群中沒有兩個個體的基因組DNA是完全相同的。

　　DNA的多態性雖可通過DNA測序檢出，但用限制酶消化卻是最常用的檢測方法。

　　1．RFLP由于堿基的變異可能導致酶切點的消失或新的切點出現，從而引起不同個體在用同一限制酶切時，DNA片段長度出現差異（圖13－3)，這種由于內切酶切點變化所導致的DNA片段長度的差異，稱為限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymporphism, RFLP)。RFLP反映了常見的個體間DNA核苷酸的可遺傳性變異，它按照孟德爾方式遺傳。RFLP可用Southern印跡雜交法（見下節)檢出。用Southern雜交檢出RFLP時，如探針跨越切點，則被切開的兩個片段均可與探針雜交，從而顯示兩條雜交帶（圖13－4)。

圖13－3 RFLP示意圖箭頭酶切位點；

左圖：等位基因2由于出現新的切點，DNA片段縮至8kb;

右圖：DNA片段電泳后雜交圖

13－4 RFLP的檢出等位基因1因有額外切點而導致產生

兩個長短不同的DNA片段（3kb及5kb)且均能與探針雜交

　　2．兩點RFLP

　　（1)點多態（point polymorphism)：是由于單個或少數堿基的改變引起酶切點的出現或消失所致的RFLP。上述的RFLP即屬于這一類。它們屬經典的RFLP。在人類基因組中已發現數以百計的此類多態位點。

　　（2)數目變異的串連重復（variable number tandem repeats,VNTR)：上述經典的單個堿基取代所致的RFLP一般只能檢測到一種雜合性的兩種形式，即“有”或“無”某個限制酶切位點，而且每個位點在人群中的雜合子頻率通常不會超過50％，當被測個體為純合狀態時，利用RFLP就無法得到所需要的多態信息。此外，在整個基因組中，這類RFLP目前發現的數量還有限，并分布不勻。

　　但是，在人類基因組中還存在一類DNA重復序列，稱為小衛星DNA。它們分布十分廣泛，每一個單位通常只有16-28bp長，但其重復次數在人群中是高度變異的。當用限制酶切割VNTR區時，只要酶切點不在重復區內，就可能得到各種長度不同的片段（圖13－5)

　　與小衛星DNA不同，另一類重復序列是衛星DNA。它們的基本序列有1－6bp，如（TA)n、(CGG)n等，通常重復10－60次并呈高度的多態性。

　　VNTR具有高度的變異性，同時也是按照孟德爾方式遺傳的，因此是很好的遺傳標記，由于它們類型眾多和在基因組中分布廣泛，因而在基因連鎖診斷中應用日益廣泛。